Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse
Summary
PCR combinée à l'analyse de fusion à haute résolution (AGRH) est démontré comme une méthode rapide et efficace de déterminer le génotype du poisson zèbre.
Abstract
Le poisson zèbre est un système de modèle vertébré puissant pour étudier le développement, la modélisation de la maladie, et en effectuant le criblage de médicaments. Récemment, une variété d'outils génétiques ont été mis en place, y compris des stratégies multiples pour induire des mutations et de générer des lignées transgéniques. Cependant, le dépistage à grande échelle est limitée par des méthodes de génotypage traditionnels, qui prennent beaucoup de temps et de main-d'œuvre. Nous décrivons ici une technique pour analyser les génotypes de poisson zèbre par PCR combinées avec l'analyse à haute résolution fusion (AGRH). Cette approche est rapide, sensible et peu coûteux, avec un risque plus faible d'objets de contamination. Le génotypage par PCR avec HRMA peut être utilisé pour des embryons ou des poissons adultes, y compris dans des protocoles de criblage à haut débit.
Introduction
Poisson zèbre (Danio rerio) est un système de modèle vertébré largement utilisé pour les études de développement et de modélisation de la maladie. Récemment, de nombreuses technologies transgéniques et de mutation ont été développés pour le poisson zèbre. Techniques de transgénèse rapides, généralement basés sur un système de transposon Tol2 1, ont été combinées avec une amélioration des options de clonage multiple pour l'assemblage de fragments d'ADN 2. Nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) ont été utilisées pour cibler les lieux dans les cellules somatiques et germinales chez le poisson zèbre 3,4. Ces techniques peuvent générer efficacement des animaux génétiquement modifiés, avec la création de mutation à haute fréquence et la transmission de la lignée germinale 3,4.
Malgré ces avancées, les techniques de génotypage traditionnels chez le poisson zèbre limiter la puissance des outils de mutagenèse et la transgenèse. PCR suivie d'une électrophorèse sur gel, parfois combinée à RESTRICTIOn digestion avec des enzymes, est largement utilisée pour détecter la modification du génome, mais est longue et moins sensible pour identifier de petites insertions ou délétions. essais de sonde TaqMan ont des coûts initiaux élevés et nécessitent une optimisation soignée. Le séquençage des produits de PCR peut prendre plusieurs jours et n'est pas pratique pour le dépistage à grande échelle. longueur des fragments de restriction (RFLP) analyse ne peut discriminer SNP affectant un nombre limité de sites de reconnaissance des enzymes de restriction.
Analyse à haute résolution fusion (HRMA), un post-PCR méthode d'analyse en tube fermé, est un procédé récemment mis au point qui est rapide, sensible, peu coûteux, et aptes à la sélection de grands nombres d'échantillons. HRMA peut être utilisé pour détecter des SNP, les mutations et les transgènes 7.5. HRMA est basé sur la dénaturation thermique des ADN double brin, et chaque amplicon de PCR a une dissociation uniques (fondre) caractéristique 5. Les échantillons peuvent être victimes de discrimination en raison to leur composition différente de nucléotides, contenu GC, ou longueur, généralement en combinaison avec un colorant fluorescent qui se lie uniquement l'ADN double brin 8. Ainsi, HRMA peut distinguer différents génotypes sur la base des caractéristiques différentes à l'état fondu de courbe. Parce que HRMA utilise des réactifs à faible coût et est un processus post-PCR en une seule étape, il peut être utilisé pour des stratégies à haut débit. HRMA est non destructive, si suite à l'analyse des amplicons PCR peuvent être utilisés pour d'autres applications. HRMA a été appliqué dans de nombreux organismes, y compris les systèmes et les lignées cellulaires, les souris et les humains 9-11. Son utilisation a été récemment décrit dans le poisson zèbre pour détecter des mutations induites par les nucléases à doigt de zinc (ZFN) et Talens 6,12,13.
Dans cet article, nous décrivons comment effectuer HRMA basée sur la PCR chez le poisson zèbre embryonnaire et adulte (figure 1). Ce protocole est adapté pour détecter des SNP, les transgènes et les mutations, notamment single changements de paires de bases, des insertions ou des suppressions.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR combinée avec HRMA est une technologie puissante pour le génotypage du poisson zèbre. Les avantages de cette approche sont sa vitesse, la robustesse et la sensibilité à détecter même des mutations ponctuelles. L'ensemble du protocole, à partir de la cassette d'analyse ailette pour faire fondre la courbe, peut être effectuée en moins de huit heures par une seule personne. De plus, la technique est susceptible de criblage à haut débit, ne nécessite pas l'utilisation de bromure d'éthidium,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres des Blaschke, Grunwald, et Wittwer laboratoires pour obtenir des conseils et une assistance technique. Ce travail est soutenu par la Fondation PCMC, NIH R01 MH092256 et DP2 MH100008, et le Mars de Dimes Foundation subvention de recherche n ° 1-AF13-425, à JLB.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
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