快速，高效的斑马鱼基因分型采用PCR与高分辨率熔体分析
Summary
PCR结合高分辨率的熔融分析（HRMA）被证明是一种快速，有效的方法，以斑马鱼的基因型。
Abstract
斑马鱼是研究开发，造型疾病，并进行药物筛选功能强大的脊椎动物模型系统。最近的各种遗传工具的相继出台，其中包括诱导突变并产生转基因株系多种策略。然而，大规模的筛选是通过传统的基因分型方法，这是耗时耗力的限制。在这里，我们描述的技术来分析斑马鱼的基因型PCR结合高分辨率熔解分析（HRMA）。这种方法快速，灵敏，而且价格便宜，具有污染器物风险较低。基因分型的PCR与HRMA可以用于胚胎或成年鱼，包括高通量筛选的协议。
Introduction
斑马鱼（ 斑马鱼 ）是脊椎动物模型系统广泛用于开发和疾病模型的研究。最近，众多的转基因和基因突变技术已经开发了斑马鱼。快速的转基因技术，通常根据一个TOL2座子系统1中，已合并为多个DNA片段组件2改进的克隆选择。锌指核酸酶（ZFN）和转录活化因子样效应物核酸酶（TALENS）已被用于靶向基因座在两个体细胞和生殖系细胞，斑马鱼3,4。这些技术可以有效地产生转基因动物，具有高频突变的创建和种系传递3,4。
尽管取得了这些进展，在传统的斑马鱼基因分型技术限制的诱变和转基因工具的全部功能。 PCR然后进行凝胶电泳，有时结合不受限制。Ñ酶消化，被广泛用于检测基因组的修饰，但很费时，并确定小插入或缺失不敏感。 TaqMan探针检测具有较高的初始成本，需要仔细优化。 PCR产物的测序可能需要几天时间，并且是不实用的大规模筛选。限制性片段长度多态性（RFLP）分析，只能判别影响的限制性内切酶识别位点的一个有限的范围内的SNP。
高分辨率熔解分析（HRMA），封闭管后的PCR分析方法，是一种最近开发的方法，该方法快速，灵敏，价格低廉，适合于筛选大量样品。 HRMA可用于检测单核苷酸多态性，突变，和转基因5-7。 HRMA是基于双链DNA热变性，并且每个PCR扩增子具有唯一的解离（熔体）特性5。样品可以分辨由于吨ø其不同的核苷酸组成，GC含量，或长度，通常在用荧光染料的组合，只有结合双链DNA 8。因此，HRMA可以基于不同的熔融曲线的特征区分不同基因型。因为HRMA使用廉价的试剂和是一个单步PCR后的过程中，它可用于高通量的策略。 HRMA是破坏性的，所以下面的分析将PCR扩增子可以用于其他应用。 HRMA已在许多生物和系统，包括细胞系，小鼠和人类9-11中得到应用。它的使用最近在斑马鱼被描述检测由锌指核酸酶（ZFN）和塔伦斯6,12,13突变。
在本文中，我们将描述如何在胚胎和成年斑马鱼进行基于PCR的HRMA（ 图1）。这个协议是适合于检测单核苷酸多态性，转基因，和基因突变，包括SIngle碱基对的改变，插入或缺失。
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR结合HRMA是一种功能强大的技术，斑马鱼基因分型。这种方法的优点是它的速度，鲁棒性，以及灵敏度来检测偶数的点突变。整个协议，从翅片夹熔化曲线分析，可在少于八小时由个人执行的。此外，该技术是适合于高通量筛选;不需要使用溴化乙锭;和密封所有PCR和分析步骤，这有助于减少污染的问题。
这种技术的一个关键步骤是PCR扩增子和引物设计。典型的长度为PCR?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢布拉施克，格伦沃尔德和WITTWER实验室的咨询和技术援助的成员。这项工作是由PCMC基金会，美国国立卫生研究院R01 MH092256和DP2 MH100008和优生优育基金会的研究经费＃1-FY13-425的3月，为广东健力宝的支持。
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
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