Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse
Summary
PCR in combinatie met hoge-resolutie smelt analyse (HRMA) wordt aangetoond als een snelle en efficiënte methode om zebravis genotype.
Abstract
Zebravis is een krachtig gewerveld modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling, ziekte modelleren en uitvoeren drug screening. Onlangs zijn ingevoerd verschillende genetische hulpmiddelen, waaronder meerdere strategieën voor het induceren mutaties en transgene lijnen. Echter, grootschalige screening beperkt door genotypering traditionele methoden, die tijdrovend en arbeidsintensief zijn. Hier beschrijven we een techniek om zebravis genotypen door PCR in combinatie met hoge-resolutie smeltende analyse (HRMA) te analyseren. Deze aanpak is snel, gevoelig en goedkoop, met een lager risico van besmetting artefacten. Genotypering door PCR met HRMA kan worden voor embryo's en volwassen vis, met inbegrip van hoog-protocollen.
Introduction
Zebravis (Danio rerio) is een gewerveld dier modelsysteem op grote schaal gebruikt voor onderzoek naar ontwikkeling en ziekte modellering. Onlangs hebben talrijke transgene en mutatie technologieën ontwikkeld voor zebravis. Snelle transgenese technieken, meestal gebaseerd op een Tol2 transposon systeem 1, zijn gecombineerd met verbeterde klonen opties voor meerdere DNA-fragment assembly 2. Zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) zijn gebruikt om loci richten zowel somatische en kiemlijn cellen in zebravis 3,4. Deze technieken kunnen efficiënt genereren van genetisch gemodificeerde dieren, met een hoge frequentie mutatie creatie en kiem-lijn transmissie 3,4.
Ondanks deze vooruitgang, traditionele genotypering technieken in zebravis beperken de volledige kracht van de mutagenese en transgenese gereedschappen. PCR gevolgd door gelelektroforese, soms gecombineerd met BEPERKINGEn enzymdigestie, wordt veel gebruikt om genoom modificatie detecteren, maar is tijdrovend en minder gevoelig voor kleine inserties of deleties identificeren. TaqMan probe assays hebben hoge initiële kosten en vereisen een zorgvuldige optimalisatie. Sequencing van PCR-producten kan enkele dagen duren en is niet praktisch voor grootschalige screening. Restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) analyse kan alleen onderscheid SNP's die een beperkt aantal restrictie-enzym herkenningsplaatsen.
Hoge-resolutie smeltpunt analyse (HRMA), een gesloten buis na PCR analysemethode, is een recent ontwikkelde methode die snelle, gevoelige, goedkoop en vatbaar voor het screenen van grote aantallen monsters. HRMA kan worden gebruikt om SNPs, mutaties en transgenen 5-7 detecteren. HRMA is gebaseerd op thermische denaturatie van dubbelstrengs DNA, en elke PCR-amplicon een unieke dissociatie (smelt) karakteristiek 5. Monsters kunnen worden gediscrimineerd te wijten to hun verschillende nucleotide samenstelling GC inhoud of diepte, typisch in combinatie met een fluorescente kleurstof die alleen bindt dubbelstrengs DNA 8. Aldus kan HRMA verschillende genotypen onderscheiden op basis van de verschillende smelt-curve karakteristieken. Omdat HRMA gebruikt goedkope reagentia en is een stap na PCR-proces kan worden gebruikt voor high-throughput strategieën. HRMA wordt destructief, dus na de analyse van de PCR amplicons worden gebruikt voor andere toepassingen. HRMA is toegepast in vele organismen en systemen, waaronder cellijnen, muizen en mensen 9-11. Het gebruik ervan is onlangs in de zebravis is beschreven dat mutaties veroorzaakt door zinc finger nucleases (ZFNs) Talens en 6,12,13 detecteren.
In dit artikel beschrijven we hoe de PCR-gebaseerde HRMA voeren in embryonale en volwassen zebravissen (figuur 1). Dit protocol is geschikt voor het detecteren van SNPs, transgenen en mutaties, zoals single veranderingen baseparen, inserties of deleties.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR gecombineerd met HRMA is een krachtige technologie voor zebravis genotypering. De voordelen van deze benadering zijn snelheid, robuustheid en gevoeligheid voor zelfs puntmutaties te detecteren. De gehele protocol, van fin-clip te smelten-curve analyse kunnen worden in minder dan acht uur uitgevoerd door een enkel individu. Bovendien is de techniek vatbaar voor hoge-doorvoer screening, niet het gebruik van ethidium bromide vereist, en is afgesloten voor alle PCR en analysestappen die helpt minimaliseren verontreinigi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de Blaschke, Grunwald, en Wittwer labs voor advies en technische bijstand. Dit werk wordt ondersteund door de PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 en DP2 MH100008, en de March of Dimes Foundation onderzoek subsidie # 1-FY13-425, naar JLB.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
