سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب
Summary
ويتجلى PCR جنبا إلى جنب مع تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) كوسيلة سريعة وفعالة إلى التركيب الوراثي الزرد.
Abstract
الزرد هو نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة التنمية، والنمذجة المرض، وإجراء فحص المخدرات. وقد تم مؤخرا عرض مجموعة متنوعة من الأدوات الجينية، بما في ذلك استراتيجيات متعددة لإحداث طفرات وتوليد خطوط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، وفحص واسعة النطاق محدودة بسبب أساليب التنميط الجيني التقليدية، والتي هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. نحن هنا وصف تقنية لتحليل الأنماط الجينية الزرد بواسطة PCR جنبا إلى جنب مع تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA). هذا النهج هو سريعة وحساسة، وغير مكلفة، مع خطر أقل من التحف التلوث. التنميط الجيني بواسطة PCR مع HRMA يمكن استخدامها لأجنة الأسماك أو الكبار، بما في ذلك بروتوكولات الفرز الفائق الإنتاجية.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) هو نظام نموذجي الفقارية المستخدمة على نطاق واسع لدراسات التنمية والنمذجة المرض. مؤخرا، تم تطوير العديد من التقنيات المعدلة وراثيا وتحور لالزرد. تقنيات نقل الجينات السريع، وعادة ما يعتمد على نظام ينقول Tol2 1، وقد تم جنبا إلى جنب مع تحسين خيارات متعددة لاستنساخ الحمض النووي التجمع جزء 2. وقد استخدمت nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs) لاستهداف مواضع في كل من الخلايا الجسمية وسلالة الجرثومية في الزرد 3،4. ويمكن لهذه التقنيات بكفاءة توليد الحيوانات المعدلة وراثيا، مع خلق طفرة عالية التردد، ونقل خط الجرثومية 3،4.
على الرغم من هذه التطورات، وتقنيات التنميط التقليدي في الزرد لحد من القوة الكاملة للالطفرات ونقل الجينات الأدوات. يتبع PCR بواسطة الكهربائي للهلام، جنبا إلى جنب في بعض الأحيان مع restrictioن انزيم الهضم، ويستخدم على نطاق واسع للكشف عن تعديل الجينوم، ولكن هو مضيعة للوقت وأقل حساسية لتحديد الإدراج أو الحذف صغيرة. المقايسات TaqMan التحقيق ديك التكاليف الأولية عالية وتتطلب حذرا الأمثل. تسلسل المنتجات PCR يمكن أن يستغرق عدة أيام وليس عملية لفحص واسعة النطاق. تقييد جزء طول تعدد الأشكال (RFLP) التحليل يمكن أن تميز فقط تعدد الأشكال التي تؤثر على مجموعة محدودة من المواقع الاعتراف انزيم التقييد.
تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA)، مغلقة أنبوب آخر-PCR تحليل الأسلوب، هو طريقة تم تطويرها مؤخرا أن يكون سريعا وحساسة، وغير مكلفة، وقابلة للفحص عدد كبير من العينات. HRMA يمكن استخدامها للكشف عن تعدد الأشكال، والطفرات، والجينات المحورة 5-7. ويستند HRMA على تمسخ الحرارية للسلطات الوطنية المعينة المزدوج تقطعت بهم السبل، ولكل AMPLICON PCR لديه تفارق فريد (تذوب) مميزة 5. عينات يمكن تمييز بسبب رس بهم تكوين مختلف النوكليوتيدات، والمحتوى GC، أو طول، وعادة في تركيبة مع صبغة الفلورسنت التي تربط فقط المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي 8. وبالتالي، يمكن التمييز بين الأنماط الجينية HRMA المختلفة استنادا إلى خصائص مختلفة تذوب منحنى. لأن HRMA يستخدم الكواشف منخفضة التكلفة ويبعد خطوة واحدة بعد PCR العملية، فإنه يمكن استخدامها لاستراتيجيات عالية الإنتاجية. HRMA هو غير تدميري، لذلك بعد تحليل يمكن استخدام amplicons PCR لتطبيقات أخرى. وقد تم تطبيق HRMA في العديد من الكائنات الحية والنظم، بما في ذلك خطوط الخلايا والفئران والبشر 9-11. وقد تم مؤخرا وصفت استخدامه في الزرد للكشف عن الطفرات المستحثة بواسطة nucleases إصبع الزنك (ZFNs) وTALENs 6،12،13.
في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية تنفيذ HRMA PCR القائم في الزرد الجنينية والكبار (الشكل 1). هذا البروتوكول هو مناسبة للكشف عن تعدد الأشكال، الجينات المحورة، والطفرات، بما في ذلك الاشتراكيةngle التغييرات قاعدة الزوج، والإدراج، أو حذف.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR جنبا إلى جنب مع HRMA هي تقنية قوية لالتنميط الجيني الزرد. مزايا هذا النهج هي سرعته، متانة، وحساسية للكشف عن الطفرات حتى النقطة. بروتوكول بأكمله، من زعنفة كليب التحليل لتذوب منحنى، لا يمكن أن يؤديها في أقل من ثماني ساعات من قبل فرد واحد. بالإضافة إلى ذلك، والتقنية هي ق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء Blaschke، جرونوالد، وتوير مختبرات للحصول على المشورة والمساعدة التقنية. ويدعم هذا العمل من قبل مؤسسة PCMC، المعاهد الوطنية للصحة R01 MH092256 وDP2 MH100008، ومارس من الدايمات مؤسسة منحة بحثية # 1-FY13-425، لJLB.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
