Kapsamlı Cochlear Proteome tanımak için aşağıdan yukarıya ve Shotgun Proteomiks
Summary
Membran proteinleri izole etmek ve tanımlamak zordur çünkü koklear duyu epitel Proteom analizi nedeniyle küçük boyutu ve zor olabilir. Zar ve çözülebilir proteinler, her ikisi de yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte birden hazırlama yöntemleri ve ayırma teknikleri birleştirilerek tanımlanabilir.
Abstract
Proteomiks karmaşık biyolojik sistemlerin içgörü sağlayabilir yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Koklear duyusal epitelyum, periferal ve merkezi sinir sistemi tarafından işlenen bir elektro-kimyasal enerjiye sesin mekanik enerji transdüksiyonu reseptörlerini içerir. Çeşitli proteomik teknikler, iki boyutlu bir fark jel elektroforezi (2D-DIGE), antikor mikrodizi ve kütle spektrometrisi (MS) halinde koklear iç kulak, çalışma için geliştirilmiştir. MS proteomikteki en kapsamlı ve çok yönlü bir araçtır ve ayırma yöntemleri ile birlikte biyolojik örneklerin derinlemesine bir proteomesini sağlayabilir. MS ile birlikte ayırma yöntemleri, protein örnekleri ettirecek düşük bir molekül ağırlığı ve hidrofobik proteinleri tespit ve proteom dinamik aralığını azaltarak düşük bol proteinleri tespit etmek yeteneğine sahiptir. Farklı sindirim stratejiler peptid ve protein geliştirmek için bütün lisat ya da parçalanmış protein lisatı uygulanabilirdizisi kapsama. Güçlü katyon alışveriş (SCX), ters faz (RP) ve jel elüt sıvı fraksiyon tuzak elektroforezi (GELFrEE) dahil olmak üzere farklı ayırma tekniklerinin kullanımı protein belirlenmesi için önceki MS analizi için numune karmaşıklığını azaltmak için uygulanabilir.
Introduction
Proteomiks protein ifadesi, işlev, değişiklik ve etkileşimleri 1 analiz karmaşık biyolojik sistemlerin çalışmadır. Çeşitli yöntemler, antikor mikrodizi 2, iki boyutlu jel elektroforezi 3-5 ve dige 6 da dahil olmak üzere, iç kulak bölgesinin proteom analizi için kullanılmıştır. Bununla birlikte, proteinlerin sadece sınırlı sayıda tespit edilmiştir ve iç kulak 11,12 belirlenen genler ve 10.000 'den fazla edilen sunulan sekans bölümlerinin (EST) ile karşılaştırıldığında, 2,7-10, özelliği, MS, en yaygın olarak kullanılan ve kapsamlı bir tekniktir protein karakterizasyonu için proteomikteki. Gibi koklea gibi karmaşık proteomik numunelerin, analiz, zor olabilir. Bununla birlikte, MS ile birden fazla ayırma tekniklerinin bir kombinasyonu nedeniyle artan bir dinamik konsantrasyon aralığında ve en yüksek kapasite 13, peptidlerin ve proteinlerin, bir daha fazla sayıda tanımlanmasını sağlar. Çok boyutlu kromatografikphy farklı adsorpsiyon mekanizmalarının kullanımına izin vererek son derece kompleks protein karışımları azaltır. İki sık kullanılan MS proteomdaki çözümleme yaklaşımları, av tüfeği ve aşağıdan yukarıya proteomiks vardır. Av tüfeği proteomik, sağlam proteinlerin bir karışımı enzimatik olarak sindirilir ve güçlü katyon değişim kromatografisi, ters faz sıvı kromatografisi (RPLC) 14,15 ve ardından (SCX) ile çok boyutlu kromatografi kullanılarak ayrılır. Ayrılmış peptidler tandem MS tabi ve veritabanı 15 arıyor. Bu tekniğin önemli bir avantajı protein binlerce tek analizinde tespit edilebilir ve teknik membran proteinleri için daha uygun olmasıdır.
Aşağıdan yukarıya yaklaşımda, protein kanşım genellikle bir ya da iki boyutlu elektroforez ile ayrılır, ve tek tek protein bantları ya da noktalar genellikle birden peptidler ile sonuçlanır, tripsin gibi bir enzim ile kesilir ve sindirilmiştir. Ancak, başka bir daha yenily aşağıdan yukarıya proteomikteki kullanılan elektroforetik yaklaşım geliştirdi, GELFrEE olduğunu. Bu teknik, sıvı-faz içinde protein örnekleri böler ve analizden önce için daha az karmaşık hale getirir. Bu teknik, tekrar üretilebilir yüksek protein iyileşme sağlar ve karmaşık protein örnekleri 16 yüksek fazla proteinler dağılımını azaltır. Ayrılmış proteinlerinden elde edilen peptidler, 17-19 veritabanı arama için sekans etiketler oluşturmak için, peptid kütle parmak izi ya da tandem MS (MS / MS) kullanılarak, MS ile analiz edilir. Aşağıdan yukarıya yaklaşım kullanarak önemli avantajlarından bazıları yüksek çözünürlüklü ayrımları ve kapsamlı protein kapsama almak için yeteneği vardır. Aşağıdan yukarıya proteomiks proteomiks 20 en çok kullanılan tekniktir, dolayısıyla, çeşitli biyoinformatik araçları mevcuttur. Buna ek olarak, proteinler, sindirim önce bir karışım olarak ayrılabilir, böylece daha büyük bir kimlik olasılığı vardır.
Önemli sorunlardan biriproteomik analizi için iç kulağı kullanarak kendi küçük boyutu, sınırlı erişilebilirlik ve hücre tipi çeşitlilik 21'dir. Buna ek olarak, bu tür iyon kanalları, taşıyıcı ve reseptör olarak özelliğe ayırt anahtar proteinler, 22, izole etmek zor olabilir zar proteinleri vardır. Bu nedenle, filtre destekli numune hazırlama (FASP) protein çıkarımı için sınırlıdır dokuların proteomik analizler için avantajlıdır ve membranlar 23 çözündürülmesi için deterjan gerektirir. Bu filtre membran ve çözünebilir proteinlerin MS analizi için ve düşük molekül ağırlıklı kirletici 23,24 peptidler izole etmek yeteneği sağlar.
Mevcut protokol birleştirildi ve çözünebilir ve membran proteinleri de analiz etmek ve koklear duyu epitel protein kimliklerinin sayısını arttırmak için modifiye sık kullanılan proteomik yaklaşımlar anlatılmaktadır. Biz FASP çok sindirimi ile av tüfeği proteomiks kullanarak anlatacağıziyon, iyon değiştirme kromatografisi, yüksek çözünürlüklü MS ve veri analizi. Buna ek olarak, biz GELFrEE, FASP çok sindirim, yüksek çözünürlük MS, ve veri analizi ile aşağıdan yukarıya proteomiks anlatacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koklear duyu epitel protein kimlik maksimize önemli adımlar şunlardır: sindirim için birden endoproteinazlara 1) kullanımı, birden fazla ayırma teknikleri 2) kullanımı ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi 3) kullanımı. Birden enzimlerin uygulanması peptidlerin sayısını arttırır ve protein dizisi kapsama geliştirir, bu nedenle koklear dokudan belirlenen protein sayısını artırır. Tripsin, en yaygın olarak kullanılan proteaz MS iyonlaşma ve parçalanması için iyi olan pepti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Kent Seeley, bu tesisin kullanımı için Güney Florida Üniversitesi İlaç Keşif ve Yenilik Merkezi (CDDI) Proteomiks Çekirdek Tesis Direktörü teşekkür ederim. Bu çalışma Bhas NIH / NIDCD hibe R01 DC004295 tarafından desteklenen
Materials
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm × 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
References
- Domon, B., Aebersold, R. Review – Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
- Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
- Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
- Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. . The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).
- Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
- Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
- Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
- Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. . Plos One. 6, (2011).
- Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
- Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
- Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
- Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
- Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
- Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
- Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
- Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down’ protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
- Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
- Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
- Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
- Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O’Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).
