Summary
Proteomanalyse des Cochlea-sensorischen Epithel kann eine Herausforderung aufgrund seiner geringen Größe und weil Membranproteine sind schwer zu isolieren und zu identifizieren. Sowohl Membran und lösliche Proteine können durch die Kombination mehrerer Herstellungsverfahren und Trennverfahren mit hochauflösenden Massenspektrometrie identifiziert werden.
Abstract
Proteomik ist eine häufig verwendete Ansatz, der Einblicke in komplexe biologische Systeme bieten können. Die Cochlea Sinnesepithels enthält Rezeptoren, die mechanische Energie der Ton in einer elektrochemischen Energie durch die peripheren und zentralen Nervensystem verarbeitet zu transduzieren. Mehrere Proteomics Techniken entwickelt worden, um die Cochlea Innenohr, wie zum Beispiel zweidimensionale Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE), Antikörper-Microarray und Massenspektrometrie (MS) zu untersuchen. MS ist die umfassende und vielseitiges Werkzeug in der Proteomik und in Verbindung mit Trennverfahren kann eine eingehende Proteom von biologischen Proben. Trennmethoden in Kombination mit MS hat die Fähigkeit, Proteinproben zu bereichern, zu erkennen niedrigem Molekulargewicht und hydrophoben Proteinen und identifizieren niedrigen reichlich Proteine, die durch die Verringerung der Proteom-Dynamikbereich. Verschiedene Strategien zur Verdauung gesamte Lysat oder fraktionierte Protein-Lysat aufgetragen, um Peptid-und Protein verbessernSequenzabdeckung. Die Verwendung von unterschiedlichen Trenntechniken, einschließlich starker Kationenaustausch (SCX), Reversed-Phase (RP) und geleluiert flüssige Fraktion Einschluss-Elektrophorese (GELFrEE) angewendet werden, um die Komplexität Probe vor der MS-Analyse zur Identifizierung von Proteinen zu reduzieren.
Introduction
Proteomics ist die Untersuchung komplexer biologischer Systeme durch die Analyse von Protein-Expression, Funktion, Änderungen und Wechselwirkungen ein. Verschiedene Verfahren wurden für die Proteomanalyse des Innenohrs, einschließlich Antikörper-Microarray 2, zweidimensionale Gelelektrophorese 3-5 und DIGE 6 verwendet worden. Jedoch nur eine beschränkte Anzahl von Proteinen identifiziert und charakterisiert 2,7-10, im Vergleich zu den mehr als 10.000 Gene und exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) in das Innenohr 11,12 identifiziert, MS ist das am häufigsten verwendete und umfassende Technik in der Proteomik zur Proteincharakterisierung. Proteom-Analyse von komplexen Proben, wie der Cochlea, kann schwierig sein. Allerdings ist die Kombination von mehreren Trenntechniken mit MS ermöglicht die Identifizierung einer größeren Anzahl von Peptiden und Proteinen aufgrund einer erhöhten dynamischen Konzentrationsbereich und die Spitzenleistung 13. Mehrdimensionale ChromatographiePHY reduziert sehr komplexe Proteingemische indem die Verwendung von verschiedenen Mechanismen Adsorption. Es gibt zwei häufig verwendete MS Proteomanalyse Ansätze, Schrotflinte und Bottom-up-Proteomics. Schrotflinte in der Proteomik, wird eine Mischung von intakten Proteinen enzymatisch verdaut und getrennt unter Verwendung multidimensionaler Chromatographie mit einem starken Kationenaustausch-Chromatographie (SCX), gefolgt von Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (RPLC) 14,15. Die getrennten Peptide an Tandem-MS unterzogen und Datenbank-Suche 15. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Tausende von Proteinen in einer einzigen Analyse identifiziert werden, und die Technik ist besser, Membranproteine geeignet.
Im Bottom-up-Ansatz wird das Proteingemisch abgetrennt, in der Regel durch ein-oder zweidimensionale Elektrophorese, und die einzelnen Proteinbanden oder Flecken ausgeschnitten und mit einem Enzym wie Trypsin verdaut, was in der Regel mehrere Peptide. Jedoch kann eine andere neuerely entwickelt elektrophoretische Ansatz, in bottom-up Proteomik verwendet wird, ist GELFrEE. Diese Technik fraktioniert Proteinproben in flüssiger Phase und macht sie weniger komplex vor der Analyse. Diese Technik ist reproduzierbar, bietet eine hohe Proteinausbeute und reduziert den Vertrieb von qualitativ vorkommenden Proteine in komplexen Proteinproben 16. Peptide aus getrennten Proteine entstehen, werden von MS analysiert, mithilfe von Peptidmassenfingerprinting-oder Tandem-MS (MS / MS), um Sequenz-Tags für die Datenbanksuche 17-19 erstellen. Einige der wichtigsten Vorteile der Verwendung des Bottom-up-Ansatz sind die Fähigkeit, hochauflösende Trennungen und umfassende Berichterstattung Protein zu erhalten. Bottom-up Proteomik ist die am häufigsten verwendete Technik in der Proteomik 20, daher sind mehrere Bioinformatik-Werkzeuge zur Verfügung. Darüber hinaus können Proteine in einem komplexen Gemisch vor Verdauung getrennt werden, so gibt es eine größere Wahrscheinlichkeit der Identifikation.
Eine der großen Herausforderungenim Umgang mit dem inneren Ohr für Proteomanalyse ist seine geringe Größe, eingeschränkte Zugänglichkeit und Zelltyp Vielfalt 21. Zusätzlich Schlüsselproteine, die die Funktionalität unterscheiden, wie Ionenkanäle, Transporter und Rezeptoren sind Membranproteine, die schwierig sein kann, zu isolieren 22. So ist Filter gestützten Probenvorbereitung (FASP) für Proteom-Analysen von Geweben, die für die Proteinextraktion beschränkt sind vorteilhaft und Reinigungsmittel, die erfordern, um Membranen 23 zu lösen. Diese Filterung ermöglicht die MS-Analyse von Membran-und löslichen Proteinen und für die Fähigkeit, Peptide, die von niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen 23,24 isolieren.
Dieses Protokoll beschreibt häufig verwendete Proteomics, die kombiniert werden und geändert werden, um lösliche und Membranproteine zu analysieren und um die Anzahl der Protein-IDs aus der Cochlea Sinnesepithels maximieren. Wir beschreiben mit Shotgun Proteomics mit FASP Mehr verdauenIonen, Ionenaustausch-Chromatographie, hochauflösende MS, und Datenanalyse. Darüber hinaus werden wir Bottom-up Proteomik mit GELFrEE, FASP Mehr Verdauung, hochauflösende MS und Datenanalyse zu beschreiben.
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Protocol
Ethikerklärung
Experimente mit Mäusen Gewebe wurden von der University of South Florida Institutional Animal Care und Verwenden Committee (Protokolle 3931R, 3482R) zugelassen nach unter den Richtlinien der National Institutes of Health gesetzt.
1. Proteinextraktion
- Isolieren Cochlea sensorischen Epithel von 16 30 Tage alten (P30) CBA / J-Mäusen und bei -80 ° C
- Am Tag des Experiments, waschen Gewebe mit 500 &mgr; l 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifugieren für 3 min bei 1000 · g, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholt für insgesamt drei Waschungen.
- Beschallen Gewebe für 30 sec auf Eis in 100 &mgr; l Lyse-Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / ml AEBSF, 10 ug / ml Leupeptin, 100 ug / ml Pepstatin, 2 ug / ml Aprotinin und 0,5 ug / ml unter Verwendung eines Schall Microcystin Dismembrator (Modell 100, Thermo Fisher). Coole Lysat auf Eisfür 1 Minute zwischen jeder Beschallung. Beschallen insgesamt 3x.
- Zentrifugieren des Extrakts bei 750 × g bei 4 ° C für 2 min und Überstand in ein neues Mikroröhrchen. Extrahieren des Pellets in 50 &mgr; l Lyse-Puffer durch Beschallung für 30 sec auf Eis. Der Extrakt wird zentrifugiert bei 750 × g bei 4 ° C für 2 min. Kombinieren beide Lysaten und Zentrifuge bei 28.600 × g bei 4 ° C für 60 min. Den Überstand in ein neues Mikroröhrchen und mit 20 &mgr; l Lyse-Puffer, der 0,1% ASB-14 zu dem Pellet. Wirbel für 1 min und Inkubation für 60 min bei 4 ° C.
- Erwärmen die Probe bei 95 ° C für 5 min, dann kühlen auf 4 ° C für 60 min. Folgen mit Zentrifugation bei 16.000 × g bei 25 ° C für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und übertragen in ein neues Röhrchen.
- Zentrifugieren der Suspension bei 16.000 × g bei 4 ° C für 5 min und unter Beibehaltung der Überstand für die Verdauung.
2. Doppel CASO-Protein Verdauung von Whole Lysate Mit FASP
- Fügen Sie ein 30 μl Aliquot (≤ 400 &mgr; g) der Cochlea-Proteinextrakt, enthaltend 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 0,1 M Dithiothreitol (DTT) direkt mit einem 30K Spinfilter und gemischt mit 200 ul 8 M Harnstoff in Tris-HCl. Zentrifugieren bei 14000 × g für 15 min.
- Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul 8 M Harnstofflösung und Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 min.
- Werden 10 ul 10x Iodacetamid (IAA) in 8 M Harnstofflösung zu dem Konzentrat in der Filter-und Wirbel für 1 min. Inkubieren der Spin-Filter für 20 min bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, gefolgt von Zentrifugation bei 14.000 × g für 10 min.
- 100 ul 8 M Harnstoff-Lösung zu dem Konzentrat auf der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Füge 100 &mgr; l 50 mM Ammoniumbicarbonat (ABC)-Lösung zu der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
- Hinzufügen von 0,4 &mgr; g / &mgr; l Trypsin 1:100 (w / w) Enzym-zuProtein-Verhältnis und Inkubation über Nacht (O / N) bei 37 ° C.
- Nach der Inkubation werden 40 ul 50 mM ABC-Lösung für 10 min Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 xg. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit Ameisensäure (FA) auf 1,0%, um die Verdauung zu stoppen.
- Die Filtereinheit mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, und dann waschen mit 2x 18 M 40 ul Wasser.
- Mit 100 ul 50 mM ABC Lösung waschen Sie die Filtereinheit 3x. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &mgr; g / &mgr; l Trypsin 1:100 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 37 ° C.
- Tryptischen Peptide eluieren von der zweiten Verdau durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung, um dieFiltereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat enthält die tryptischen Peptide in ein frisches Mikroröhrchen und säuert mit FA zu 1,0%.
- Die Proben können mit Hilfe der Mikro kolorimetrischen Assay mit BSA als Standard quantifiziert werden.
3. Endoproteinase LysC und CASO-Protein Verdauung von Whole Lysate Mit FASP
- Hinzufügen eines 30-ul-Aliquot (≤ 400 &mgr; g) der Cochlea-Proteinextrakt, der 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 0,1 M DTT direkt mit einem 30K Spinfilter und mit 200 &mgr; l 8 M Harnstoff in Tris-HCl-Mischungs . Zentrifugieren bei 14000 × g für 15 min.
- Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul 8 M Harnstofflösung und Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 min.
- Werden 10 ul 10x IAA in 8 M Harnstofflösung zu dem Konzentrat in der Filter-und Wirbel für 1 min. Inkubieren der Spin-Filter für 20 min bei RT im Dunkeln dann bei 14.000 × g für 10 min zentrifugiert.
- 100 l 8 M Harnstoff Solution zu dem Konzentrat auf der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Füge 100 &mgr; l 100 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
- Mit 0,1 &mgr; g / &mgr; l Endoproteinase LysC in einer 1:50 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 30 ° C.
- Nach der Inkubation werden 40 &mgr; l 100 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die LysC Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit FA auf 1,0%, um die Verdauung zu stoppen.
- Die Filtereinheit mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, und dann waschen mit 2x 18 M 40 ul Wasser.
- Mit 100 ul 50 mM ABC Lösung waschen Sie die Filtereinheit 3x. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &mgr; g / &mgr; l Trypsin 1:100 Enzym-zu-ProProtein-Verhältnis und Inkubation O / N bei 37 ° C
- Eluieren tryptischen Peptiden durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit 1,0% FA.
- Die Probe kann unter Verwendung des Mikroplatten-kolorimetrischen Test mit BSA als Standard quantifiziert.
4. Entsalzung Peptiden mithilfe der Spin Columns
- Aktivieren einer C 18-Säule MacroSpin durch Zugabe von 500 &mgr; l Acetonitril (ACN) und Zentrifugieren bei 1100 × g für 1 min. Entsorgen Sie die Durchfluss nach Zentrifugation.
- Äquilibrieren der Säule mit 500 ul 0,1% FA und Zentrifuge bei 1100 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Fügen Sie bis zu 500 ul des Peptids verdauen zu der Säule eind Zentrifuge bei 1100 g für 1 min. Wenn das Probenvolumen größer als 500 ul ist dann wiederholen Sie diesen Schritt.
- Die Säule wird mit 500 ul 0,1% FA und Zentrifuge bei 1100 × g für 1 min. Entsorgen Sie die Durchströmung. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Add 250 &mgr; l einer 90:10-ACN zu-Wasser-Verhältnis auf die Säule und Zentrifugieren bei 1.100 × g für 1 min. Sammeln Sie die Laufmittel, die die Peptide entsalzt und Transfer zu einem neuen Mikroröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Trocknen Sie die entsalzt Peptidprobe in einer Vakuumzentrifuge und komplett zu vermeiden, ließ die Probe trocken.
5. Ionenaustauschchromatographie
- Spritzen 50-100 ug verdauten Proteinprobe auf eine 200 x 2,1 mm, 5 um SCX-Säule (Polysulfoethyl A), um Peptide zu trennen.
- Verwenden eines Gradienten von 2-40% B über 50 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 250 ul / min. Lösemittel A ist 5 mM Ammoniumformiat, pH 3,0 in 25% Acetonitril und 75% ddH 2 O. Lösungsmittel B 500 mM Ammoniumformiat, pH-Wert6.0 in 25% ACN und 75% ddH 2 O.
- Überwachung der Peptidfraktionen bei 280 nm und sammelt die Fraktionen, die in 2-Minuten-Intervallen unter Verwendung eines Fraktionssammlers.
- Trocken Fraktionen im Vakuum-Konzentrator und Resuspension in 500 ul 50% Acetonitril in ddH2O mit 5% FA mit Salz Entfernung unterstützen.
- Fraktionen wieder zu trocknen und lagern bei -80 ° C bis bereit sind, für nano LC-MS/MS Analyse zu verwenden.
6. Aceton Niederschlag
Vor GELFrEE Trennung der Cochlea Proteinüberstand hat, entsalzt werden. Aceton Fällung kann verwendet werden, um Proteine zu entsalzen und konzentrieren werden.
- In drei Bänden von eiskaltem Aceton zu dem Cochlea-Überstand. Vorsichtig vortexen und Inkubation bei -20 ° CO / N.
- Zentrifugieren Sie die Proben-Mischung bei 15.000 g für 15 min bei 4 ° C und Überstand.
- Waschen des Proteinpellet 3x mit gekühltem Aceton und Zentrifuge bei 14.000 × g für 5 min bei 4° C.
- Luft trocknen den Pellet-und in 112 ul 18 M Wasser auflösen.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit Hilfe der Mikrofarbtest.
7. GELFrEE Fraktionierung von Cochlear Sinnes Epithel
- Werden 30 ul 5x Probenpuffer (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% Glycerin, 0,5% (w / v) Bromphenolblau) auf die entsalzte Protein in 112 ul 18 M suspendiert Wasser.
- Hinzufügen 8 ul 1 M DTT und Wärme bei 95 ° C für 5 min auf Protein-Disulfid-Bindungen zu reduzieren. Nach dem Erhitzen ermöglichen Abkühlen auf Raumtemperatur.
- 8 ml Laufpuffer zum Anodenbehälter, 150 ul Laufpuffer zur Sammelkammer abzutasten, und 6 ml Laufpuffer Kathodenreservoir.
- Entfernen jeder Puffer, der in der Probenaufnahmekammer mit einer Pipette geflossen sein kann.
- Last 150 ul (≤ 1 mg) der Cochlea-Proteinmischung, in die Probenaufnahmekammer mit einem 8% Trist Acetat-Patrone mit einem Massenbereich von 3,5 bis 150 kDa.
- Nieder Elektroden und Deckel schließen Instrument, um den Lauf zu starten.
- An der ersten Pausenzeit des Instruments 2 ml Laufpuffer auf den Kathodenreservoir und wieder laufen.
- Bei jeder Pause Intervall auf das Instrument, sammeln die Probe aus der Probensammelkammer mit einer Pipette und in den frisch markierten Mikroröhrchen. Waschen Sie die Sammelkammer 2x mit 150 ul Laufpuffer und entsorgen.
- In 150 ml frisches Laufpuffer auf das Probensammelkammer und wieder laufen. Sammle die Proteinfraktionen über einen Zeitraum von 2,6 h in einem Gesamtvolumen von 150 ul / Fraktion.
8. 1D-Gel-Elektrophorese von GELFrEE Fraktionen
1D-Gel-Elektrophorese verwendet werden, um die Ergebnisse aus GELFrEE Fraktionierung vor der enzymatischen Verdauung und MS-Analyse zu visualisieren. GELFrEE Proteinfraktionen können auf einem 4-15% Tris-HCl-Gel getrennt werden.
9. Protein Verdauung von GELFrEE Fraktionen Mit FASP
Eine modifizierte FASP Verfahren ist für Reinigungsmittel entfernen und Verdauung der GELFrEE Fraktionen eingesetzt.
- Fügen jedes einzelne Fraktion direkt zu einer Filtereinheit 30K, mit 200 ul 8 M Harnstoff in Tris-HCl und Zentrifugation bei 14.000 × g für 25 min gemischt.
- Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul Harnstofflösungund Zentrifuge bei 14.000 × g für 12 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Werden 10 ul 10x IAA in Harnstofflösung zu dem Konzentrat in jeder Filtereinheit, Wirbel für 1 min und Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln.
- 100 l Harnstofflösung zu dem Konzentrat auf den Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. 100 l 100 mM ABC-Lösung für die Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
- Mit 0,1 &mgr; g / &mgr; l für LysC 1:50 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis zu den Filtereinheiten und Inkubieren O / N bei 30 ° C.
- Nach der Inkubation werden 40 ul 100 mM ABC-Lösung für die Spin-Filter und Zentrifuge bei 14.000 g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Drehfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die LysC Peptide aus jedem Spin Filter in ein frisches Mikroröhrchen und säure mit trifluoroacessigsäure (TFA).
- Die Spin-Filter mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, dann waschen 2x mit 40 ul 18 M Wasser.
- Waschen Sie die Spin-Filter 3x mit 100 ul 50 mM ABC-Lösung. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &mgr; g / &mgr; l Trypsin in einer 1:100 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 37 ° C.
- Eluieren tryptischen Peptide aus jeder Filtereinheit durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung und Zentrifugieren bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
- Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu den Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide aus jeder Filtereinheit in ein frisches Mikroröhrchen und säure mit TFA.
- Trocknen Sie alle verdaut, in einem Vakuum-Konzentrator.
10. Probenvorbereitung für die LC-MS/MS
- Rekonstituieren getrocknet LysC und tryptischen Peptid verdaut Fraktionen in 20 ul 0,1% FA und Wirbel.
- Zentrifuge Proben bei 20.000 × g für 10min und entfernen Sie die obere 95% der Probe in ein neues Probengefäß.
- Injizieren 5 ul jeder Peptidfraktion auf einen 100 um x 25 mm Probenfalle, um Salze und Verunreinigungen zu entfernen, und chromatographische Trennung auf einer 75 &mgr; m × 10 cm C 18 Säule.
- Verwenden eines Gradienten von 2-40% B im Verlauf von 100 min mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 nl / min. Lösungsmittel A ist 95% ddH2O und 5% Acetonitril mit 0,1% FA. Lösungsmittel B ist 80% ACN und 20% ddH 2 O mit 0,1% FA.
- Sammeln Sie zehn Tandem-Massenspektren für jeden MS-Scan auf einem hochauflösenden Massenspektrometer. Ein LTQ Orbitrap-Massenspektrometer wurde in diesem Experiment verwendet.
11. Proteinidentifizierung
- Identifizieren Proteine mit der Maus UniProt Datenbank mit Vorwärts-und Rückwärtsproteinsequenzen und gemeinsame Verunreinigungen. MaxQuant Software mit MASCOT Suchmaschine verwendet wird, um die Protein-Datenbank.
- Die Suchparameter, die verwendet werden können, umfassen, fest modification von carbamidomethyl Cystein, variable Modifikationen der Oxidation von Methionin, Protein N-terminale Acetylierung, maximal 2 verpasst Spaltung. Die Mindestpeptidlänge zu prüfen, ist für die Identifizierung sechs Aminosäuren. Geben Sie eine Peptidmassenkonzentrationsfehler von ± 8 ppm und ein Fragment Massentoleranz von 1,2 Da (Massenfehler ist abhängig von der Massenspektrometer verwendet werden).
- In der MaxQuant Software, verwenden Sie eine 1% False Discovery Rate (FDR) für Peptid-und Proteinidentifizierung. Proteinbestimmung mit der Anzahl der übereinstimm Peptide, die prozentuale Proteinsequenzabdeckung, und Peptidsequenzen aufgeführt.
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Representative Results
Um die umfassendste Proteom des Cochlea-sensorischen Epithel zu erhalten, wird schnell Gewebedissektion vor der Proteinextraktion und Probenvorbereitung erforderlich. Zwei Proteom-Techniken verwendet werden können, Schrotflinte und Bottom-up-Proteomics. Um Proben für Schrot Proteomik vorzubereiten, wurde FASP Aufschlussverfahren verwendet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Das Verfahren ermöglicht FASP Konzentration von Proteinen, die Entfernung von Detergenzien und Verdauung der Proteine mit mehreren Enzymen. Es gab zwei Doppelverdauung Verfahren verwendet, das erste war eine tryptische Verdauung, gefolgt von einer zweiten Verdauung mit Trypsin, das vereinigt wurden, auf eine SCX-Säule in 18 Fraktionen aufgetrennt und durch Nano LC-MS/MS analysiert. Insgesamt 1.485 Proteine wurden mit einer 1% FDR bei der Durchführung einer Einzel laufen LC-MS/MS mit diesem experimentellen Ansatz identifiziert. Unter den identifizierten Proteine wurden 329 und 258 Proteine in Mitochondrien und Plasmamembran (Fig. kategorisiert bzw.2A). Das zweite Doppelaufschlussverfahren bestand aus LysC Verdauung, gefolgt von Trypsin Verdauung. Jeder Digest wurde einzeln geladen und in 18 Fraktionen auf der Säule SCX getrennt und durch Nano LC-MS/MS analysiert. Die Ergebnisse des lysC-und Trypsin-Verdaus produziert insgesamt 3.503 Proteine mit einer 1% FDR. 2B zeigt, dass 605 und 617 Proteine in Mitochondrien und Plasmamembran unterteilt sind. Dieser Ansatz vorgesehen, die größte Anzahl von membranassoziierten Protein-IDs. Doppelte Analyse der LysC und Trypsin Fraktionen zeigten mehr als 65% der identifizierten Proteine wurden zwischen den Experimenten geteilt. Es gab jedoch auch neu identifizierten Proteine in der Wiederholungsanalysen. Die zusätzlichen Peptide und Proteine wurden durch kleine Änderungen in der Chromatographie identifiziert daher die zu unterschiedlichen Peptiden zur Fragmentierung 25.
Bottom-up Proteomik wurde mit GELFrEE Fraktionierung angewendetvor LC-MS/MS wie in Fig. 3 dargestellt. Es waren 12 GELFrEE Fraktionen gesammelt. Vor der Verdauung und LC-MS/MS Analyse wurde ein silbergefärbtes Gel bereit, um die Ergebnisse von GELFrEE Fraktionierung wie in Fig. 4 dargestellt visualisieren. Das Gel zeigte Proteintrennung durch die Erhöhung des Molekulargewichts für jede Fraktion in Folge. Daher wurden die 12 GELFrEE flüssigen Fraktionen mit zwei unterschiedlichen Mehr FASP Verdauungsansätze verdaut und mittels LC-MS/MS analysiert. Der erste Ansatz Verdauung wurde unter Verwendung eines Doppel-Trypsin-Verdauung, die zur Identifizierung von 2.165 Proteine mit einer 1% FDR führte bei der Durchführung einer Einzellauf LC-MS/MS. 5A zeigt, daß es 516 und 399 Proteine in Mitochondrien kategorisiert und Plasmamembran sind. Der zweite Ansatz Verdauung wurde mit Endoproteinase LysC gefolgt von Trypsin Verdauung. Einzel-run LC-MS/MS Analyse identifiziert 2.211 Proteine mit einer 1% FDR. DiesAnsatz zeigte eine ähnliche Anzahl von Membranproteine wie bei Verwendung des Trypsin / Trypsin-Ansatz (Abbildung 5B). Die Massenspektrometrie Proteomik Daten auf die ProteomeXchange Consortium 26 mit dem Datensatz-Identifizierer 25 PXD000231 hinterlegt. Kombinieren der Ergebnisse aus den verschiedenen Techniken resultiert in einer Vielzahl von Membran-und löslichen Proteinen aus der Maus Cochlea Riechepithel (Abbildung 6).
Abbildung 1. Schematische Darstellung einer Schrotflinte Proteom-Experiment mit FASP, Ionenaustausch-Chromatographie, und hochauflösende MS. Proteine werden extrahiert, solubilisiert und verdaut mit FASP mit LysC und Trypsin Endoproteinasen. Die LysC (grün Rohr) und Trypsin-Peptide (lila Rohr) in weniger komplexen Fraktionen mit SCX-Chromatographie getrennt und mit Nano LC-MS/MS analysiert. Die MASCOT Suchmaschine wurde verwendet, um die MS-Daten zur Proteinidentifizierung verarbeiten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. GO zellulären Komponenten von Protein IDs bei der Durchführung einer (A) ersten und zweiten Verdau mit Trypsin, gefolgt von Trennung und SCX (B) zunächst mit LysC Verdauung, gefolgt von einer zweiten Verdauung mit Trypsin, gefolgt von Trennung SCX. Alle Kategorien gezählt nicht ausschließlich, wenn ein Protein hat mehr als eine Kategorie für Zellkomponenten.ES.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3. Schematische Darstellung eines Bottom-up-Proteom-Experiment mit GELFrEE, FASP, und hochauflösende MS. Extrahierten Proteine solubilisiert und Proteine werden mit Aceton (blaue Röhre), um unerwünschte Salze und Verunreinigungen aus dem Lysat zu entfernen fällt. Das Protein Pellet solubilisiert und Proteine mit GELFrEE fraktioniert. Jede Fraktion wurde mit FASP mit LysC und Trypsin Endoproteinasen verdaut. Die LysC (grüne Rohre) und Trypsin-Peptide (lila Röhren) von jeder Fraktion werden mit nano LC-MS/MS und Proteine durch die Suche MS-Daten mit MASCOT identifiziert analysiert. Klicken Sie hier, um zu sehen große r Bild.
4. Silber-gefärbtes Gel Cochlea Sinnesepithels GELFrEE Fraktionen, um Proteintrennung in jeder Fraktion vor der MS-Analyse zu visualisieren. (M) Protein-Marker (1) Fraktion 1 (3) Die Fraktion 2 (5) Die Fraktion 5 (7) Fraktion 7, (8) Fraktion 8 (9)-Fraktion 9 (10), Fraktion 10 (11), Fraktion 11 (12), Fraktion 12. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung aus Darville und 24 Sokolowski. Urheberrecht 2013 von der American Chemical Society. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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5. GO zellulären Komponenten von Protein IDs bei der Durchführung einer (A) ersten und zweiten Verdau mit Trypsin nach GELFrEE Trennung und (B) zunächst mit LysC Verdauung, gefolgt von einer zweiten Verdauung mit Trypsin nach GELFrEE Trennung. Alle Kategorien sind nicht ausschließlich gezählt, wenn ein Protein mehr als eine Kategorie für zelluläre Komponenten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
6. GO zellulären Komponenten Profil für alle, die anhand SCX, WAX, oder GELFrEE Trennung Proteinen. Wenn ein Protein hatten mehr als eine Kategorie für Zellkomponenten, alle seine Kategories wurden nicht ausschließlich gezählt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Die wichtigsten Schritte zur Maximierung Proteinidentifizierung aus dem Riechepithel Cochlea sind: 1) Verwendung von mehreren Endoproteinasen für die Verdauung, 2) Verwendung von mehreren Trenntechniken, und 3) Einsatz einer hochauflösenden Massenspektrometer. Die Anwendung von mehreren Enzymen erhöht die Anzahl von Peptiden und verbessert die Proteinsequenzabdeckung, damit eine Verbesserung der Anzahl der identifizierten Proteine aus der Cochlea Gewebe. Trypsin, das am häufigsten verwendete Protease stellt eine effiziente und spezifische Spaltung von Proteinen, Peptide, die gut für MS-Ionisierung und Fragmentierung. Jedoch unter Verwendung eines anderen Enzyms vor Trypsin, wie LysC, auch spaltet Lysinrest, effizienter Peptidspaltung bietet. Es wurde beobachtet, dass die Sequenzabdeckung der aus dem LysC / Trypsin-Verdauung erzeugten Proteine zeigten einen Anstieg in der Proteinsequenzabdeckung relativ zu der Proteinsequenzabdeckung von der Trypsin / Trypsin-Verdau.
ove_content "> Umsetzung der mehrdimensionalen Trennung vor MS reduziert die hohe Cochlea Probenkomplexität in der Schrotflinte Proteom-Ansatz. Dies erlaubte die Identifizierung von Proteinen, einschließlich Membranproteine, die in der Regel schwer zu identifizieren sind. Eine größere Anzahl von Membranproteine wurden unter Verwendung von identifizierten die Schrotflinte Ansatz im Gegensatz zu dem Bottom-up-Ansatz.,. Allerdings ist die Bottom-up-Ansatz unter Verwendung GELFrEE für die Identifizierung von mehr Low vorkommenden Proteine erlaubt Diese aufgrund der Isolierung von höheren reichlich Proteine, wie Cochlin von der Cochlea, in einzelne Fraktionen.Die hohe Qualität der Daten in der vorliegenden Protokoll, das von einem hochauflösenden Massenspektrometer, wie ein LTQ-Orbitrap, verbessert und erhöht die Anzahl von Proteinen, die in der Cochlea identifiziert werden können, erreicht. Die LTQ-Orbitrap bietet hohe Auflösung, hohe Massengenauigkeit und eine hohe Empfindlichkeit für die Analyse von Peptiden. Daher Anwendung dieses Instruments enables Identifizierung von Proteinen aus komplexen biologischen Proben, wie beispielsweise die Cochlea sensorischen Epithel und verbessert Identifizierung von Peptiden niedrigen reichlich. Die Nutzung dieser kombinierten experimentellen Ansätzen mit dem mächtigen Werkzeug der MS hilft, die Cochlea-Proteindatenmenge deutlich zu erhöhen, also die Verbesserung der Möglichkeit, neuartige Protein-Biomarker im Hören und Taubheit beteiligt sind.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine Interessenskonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Kent Seeley, Direktor des Center for Drug Discovery and Innovation (CDDI) Proteomics Core Facility an der Universität von Süd-Florida für die von dieser Möglichkeit Gebrauch. Diese Arbeit wurde vom NIH / NIDCD Zuschuss R01 DC004295 zu BHAS unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm x 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
References
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