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Biology

एक व्यापक Cochlear Proteome पहचान करने के लिए नीचे अप और शॉटगन प्रोटिओमिक्स

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

झिल्ली प्रोटीन को अलग करने और पहचान के लिए मुश्किल हैं क्योंकि कर्णावत संवेदी उपकला के proteome विश्लेषण के कारण अपने छोटे आकार और चुनौतीपूर्ण हो सकता है. झिल्ली और घुलनशील प्रोटीन दोनों उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ साथ कई प्रारंभिक तरीकों और जुदाई तकनीक के संयोजन से पहचाना जा सकता है.

Abstract

प्रोटिओमिक्स जटिल जैविक प्रणालियों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है. कर्णावत संवेदी उपकला परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका प्रणाली द्वारा संसाधित एक विद्युत रासायनिक ऊर्जा में ध्वनि के यांत्रिक ऊर्जा transduce कि रिसेप्टर्स शामिल हैं. कई प्रोटिओमिक तकनीक ऐसी दो आयामी अंतर जेल वैद्युतकणसंचलन (2 डी DIGE), एंटीबॉडी माइक्रोएरे, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के रूप में कर्णावत भीतरी कान, अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. एमएस प्रोटिओमिक्स में सबसे व्यापक और बहुमुखी उपकरण है और जुदाई के तरीकों के साथ संयोजन के रूप में जैविक नमूने का एक में गहराई proteome प्रदान कर सकते हैं. एमएस के साथ संयुक्त जुदाई तरीकों, प्रोटीन के नमूने को समृद्ध कम आणविक वजन और हाइड्रोफोबिक प्रोटीन का पता लगाने, और proteome गतिशील रेंज को कम करने से कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की पहचान करने की क्षमता है. विभिन्न पाचन रणनीतियों पेप्टाइड और प्रोटीन बढ़ाने के लिए पूरे lysate करने या fractionated प्रोटीन lysate के लिए लागू किया जा सकता हैअनुक्रम कवरेज. मजबूत कटियन विनिमय (SCX), उलट चरण (आरपी), और जेल eluted तरल अंश फंसाने वैद्युतकणसंचलन (GELFrEE) सहित विभिन्न जुदाई तकनीक की उपयोगिता प्रोटीन की पहचान के लिए पूर्व एमएस विश्लेषण के लिए नमूना जटिलता को कम करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

प्रोटिओमिक्स प्रोटीन अभिव्यक्ति, समारोह, संशोधन, और बातचीत 1 का विश्लेषण करके जटिल जैविक प्रणालियों का अध्ययन है. कई तरीकों एंटीबॉडी माइक्रोएरे 2, दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन 3-5, और DIGE 6 सहित भीतरी कान की proteome विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया है. हालांकि, प्रोटीन का केवल एक सीमित संख्या में पहचान की गई है और भीतरी कान 11,12 में पहचान की 10,000 से अधिक जीन और व्यक्त अनुक्रम टैग (ESTs) की तुलना में, 2,7-10 विशेषता, एमएस सबसे अधिक इस्तेमाल किया और व्यापक तकनीक है प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए प्रोटिओमिक्स में. ऐसे कोक्लीअ के रूप में जटिल प्रोटिओमिक नमूनों के विश्लेषण, चुनौतीपूर्ण हो सकता है. हालांकि, एमएस के साथ कई जुदाई तकनीक के संयोजन के कारण एक बढ़ा गतिशील एकाग्रता रेंज और शिखर क्षमता से 13, पेप्टाइड और प्रोटीन की एक बड़ी संख्या की पहचान के लिए सक्षम बनाता है. बहुआयामी chromatograबनावट अलग सोखना तंत्र के उपयोग की अनुमति देकर अत्यधिक जटिल प्रोटीन मिश्रण कम कर देता है. दो आमतौर पर इस्तेमाल एमएस proteome विश्लेषण दृष्टिकोण, बन्दूक और नीचे अप प्रोटिओमिक्स कर रहे हैं. बन्दूक प्रोटिओमिक्स में बरकरार प्रोटीन का एक मिश्रण enzymatically पचा और मजबूत कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी उलट चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (RPLC) 14,15 द्वारा पीछा (SCX) के साथ बहुआयामी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर अलग किया जाता है. अलग हो पेप्टाइड्स मिलकर एमएस के अधीन और डेटाबेस 15 खोज रहे हैं. इस तकनीक का एक बड़ा फायदा यह प्रोटीन के हजारों एक विश्लेषण में पहचाना जा सकता है और तकनीक झिल्ली प्रोटीन के लिए बेहतर अनुकूल है.

नीचे अप दृष्टिकोण में, प्रोटीन मिश्रण आमतौर पर एक या दो आयामी वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग है, और व्यक्तिगत प्रोटीन बैंड या धब्बे आमतौर पर कई पेप्टाइड्स, जिसके परिणामस्वरूप ऐसे trypsin के रूप में एक एंजाइम के साथ बाहर कटौती और पच. हालांकि, एक और अधिक हालly नीचे अप प्रोटिओमिक्स में इस्तेमाल किया, electrophoretic दृष्टिकोण विकसित, GELFrEE है. इस तकनीक तरल चरण में प्रोटीन के नमूने fractionates और विश्लेषण करने से पहले उन्हें कम जटिल बना देता है. इस तकनीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है उच्च प्रोटीन वसूली प्रदान करता है, और जटिल प्रोटीन के नमूने 16 में उच्च प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का वितरण कम कर देता है. अलग हो प्रोटीन से उत्पन्न पेप्टाइड्स, डेटाबेस 17-19 खोज के लिए अनुक्रम टैग बनाने के लिए, पेप्टाइड जन फिंगरप्रिंटिंग या मिलकर एमएस (एमएस / एमएस) का उपयोग कर, एमएस द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. नीचे अप दृष्टिकोण का उपयोग करने का प्रमुख लाभ में से कुछ उच्च संकल्प विभाजन और व्यापक प्रोटीन कवरेज प्राप्त करने की क्षमता है. नीचे अप प्रोटिओमिक्स प्रोटिओमिक्स 20 में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है, इसलिए, कई जैव सूचना विज्ञान उपकरण उपलब्ध हैं. इसके अलावा, प्रोटीन पाचन से पहले एक जटिल मिश्रण में विभाजित किया जा सकता है, इसलिए पहचान का एक बड़ा मौका है.

प्रमुख चुनौतियों में से एकप्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए भीतरी कान का उपयोग करने में अपने छोटे आकार, सीमित पहुंच, और सेल प्रकार विविधता 21 है. इसके अलावा, इस तरह के आयन चैनल, ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स के रूप में अपनी कार्यक्षमता भेद कि प्रमुख प्रोटीन, 22 अलग करने के लिए मुश्किल हो सकता है जो झिल्ली प्रोटीन, कर रहे हैं. इस प्रकार, फिल्टर सहायता प्राप्त नमूना तैयार (FASP) प्रोटीन निकासी के लिए सीमित कर रहे हैं कि ऊतकों की प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए फायदेमंद है और झिल्ली 23 solubilize के लिए डिटर्जेंट की आवश्यकता होती है. इस फ़िल्टरिंग झिल्ली और घुलनशील प्रोटीन की एमएस विश्लेषण के लिए और कम आणविक वजन contaminants 23,24 से पेप्टाइड्स को अलग करने की क्षमता के लिए अनुमति देता है.

वर्तमान प्रोटोकॉल संयुक्त और घुलनशील और झिल्ली दोनों प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए और कर्णावत संवेदी उपकला से प्रोटीन आईडी की संख्या को अधिकतम करने के लिए संशोधित कर रहे हैं कि आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का वर्णन है. हम FASP बहु को पचाने के साथ बन्दूक प्रोटिओमिक्स का उपयोग का वर्णन करेंगेआयन, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, उच्च संकल्प एमएस, और डेटा विश्लेषण. इसके अलावा, हम GELFrEE, FASP बहु पाचन, उच्च संकल्प एमएस, और डेटा विश्लेषण के साथ नीचे अप प्रोटिओमिक्स का वर्णन करेंगे.

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Protocol

आचार विवरण

राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशा निर्देशों के तहत उल्लिखित के रूप में चूहों ऊतक का उपयोग कर प्रयोगों दक्षिण फ्लोरिडा विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल 3931R, 3482R) द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. प्रोटीन निष्कर्षण

  1. सेल्सियस -80 पर 16 से 30 दिन की उम्र में (P30) CBA / जम्मू चूहों और दुकान से कर्णावत संवेदी उपकला पृथक
  2. प्रयोग के दिन, 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 500 μl के साथ ऊतक धो लो. 1,000 XG पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटायें. तीन washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.
  3. 50 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच, 120 मिमी NaCl, 50 मिमी NAF, 5 मिमी EDTA, 500 माइक्रोग्राम / एमएल AEBSF, 10 माइक्रोग्राम / एमएल leupeptin, 100 माइक्रोग्राम / युक्त lysis बफर के 100 μl में बर्फ पर 30 सेकंड के लिए Sonicate ऊतक एक ध्वनि dismembrator (; थर्मो फिशर मॉडल 100) का उपयोग pepstatin मिलीलीटर, 2 ग्राम / एमएल aprotinin, और 0.5 ग्राम / एमएल microcystin. बर्फ पर शांत lysateप्रत्येक sonication के बीच 1 मिनट के लिए. 3x की कुल Sonicate.
  4. 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 750 XG पर निकालने अपकेंद्रित्र और एक नया microtube सतह पर तैरनेवाला हटा दें. बर्फ पर 30 सेकंड के लिए sonicating द्वारा lysis बफर के 50 μl में गोली निकालें. 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 750 XG पर निकालने अपकेंद्रित्र. 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 28,600 XG पर lysates अपकेंद्रित्र दोनों का मिश्रण. एक नया microtube सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली के लिए 0.1% ASB -14 युक्त 20 μl lysis बफर जोड़ने. भंवर 1 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते
  5. 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा तो, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी. 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर centrifugation के साथ पालन करें. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक नया ट्यूब को हस्तांतरण.
  6. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र और पाचन के लिए सतह पर तैरनेवाला बरकरार रहती है.

2. FASP का प्रयोग पूरे lysate के डबल tryptic प्रोटीन पाचन

  1. एक 30 μ जोड़ें4% सोडियम सल्फेट dodecyl (एसडीएस) युक्त कर्णावत प्रोटीन निकालने के (400 माइक्रोग्राम ≤) एल विभाज्य, 100 मिमी Tris-एचसीएल, सीधे एक 30K स्पिन फिल्टर करने के लिए पीएच 7.6 और 0.1 एम dithiothreitol (डीटीटी) और 8 के 200 μl के साथ मिश्रण Tris-एचसीएल में एम यूरिया. 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  2. 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर 8 एम यूरिया समाधान और अपकेंद्रित्र के 200 μl के साथ ध्यान केंद्रित पतला.
  3. 1 मिनट के लिए फिल्टर और भंवर में ध्यान केंद्रित करने के लिए 8 एम यूरिया के घोल में 10x iodoacetamide (आई ए ए) के 10 μl जोड़ें. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर centrifugation द्वारा पीछा अंधेरे में कमरे के तापमान (आर टी) पर 20 मिनट के लिए स्पिन फिल्टर सेते हैं.
  4. 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 8 एम यूरिया समाधान के 100 μl जोड़ें. इस कदम 2x दोहराएँ. 50 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र (एबीसी) समाधान के 100 μl जोड़ें. इस कदम 2x दोहराएँ.
  5. 1:100 में trypsin के 0.4 माइक्रोग्राम / μl जोड़ें (डब्ल्यू / डब्ल्यू) एंजाइम कोप्रोटीन अनुपात और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (ओ / एन) सेते
  6. ऊष्मायन के बाद, 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर इकाई और अपकेंद्रित्र फिल्टर करने के लिए 50 मिमी एबीसी समाधान के 40 μl जोड़ें. इस कदम 1x दोहराएँ.
  7. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर स्पिन फिल्टर और अपकेंद्रित्र के लिए 0.5 एम NaCl समाधान के 50 μl जोड़ें. एक ताजा microtube को tryptic पेप्टाइड्स युक्त छानना स्थानांतरण और पाचन को रोकने के लिए 1.0% के लिए फार्मिक एसिड (एफए) के साथ खटास लाना.
  8. 8 एम यूरिया की 40 μl के साथ फिल्टर यूनिट धो लें, और फिर 40 μl 18 MΩ पानी के साथ 2x धो लो.
  9. 50 मिमी एबीसी समाधान के 100 μl के साथ फिल्टर यूनिट 3x धो लें. अंतिम धोने 1:100 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) एंजाइम से प्रोटीन अनुपात में trypsin के 0.4 माइक्रोग्राम / μl जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते बाद
  10. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र को 50 मिमी एबीसी समाधान के 40 μl जोड़कर पचाने दूसरे से tryptic पेप्टाइड्स Elute. इस कदम 1x दोहराएँ.
  11. 0.5 एम NaCl समाधान के 50 μl जोड़ें10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र. एक ताजा microtube को tryptic पेप्टाइड्स युक्त छानना स्थानांतरण और 1.0% करने के लिए एफए के साथ खटास लाना.
  12. नमूने मानक के रूप में बीएसए का उपयोग microplate वर्णमिति परख का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

3. FASP का प्रयोग पूरे lysate के Endoproteinase lysC और tryptic प्रोटीन पाचन

  1. सीधे एक 30K स्पिन फिल्टर करने के लिए 4% एसडीएस, 100 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7.6 और 0.1 एम डीटीटी युक्त कर्णावत प्रोटीन निकालने के एक 30 μl विभाज्य (400 माइक्रोग्राम ≤) जोड़ें और Tris-एचसीएल में 8 एम यूरिया के 200 μl के साथ मिश्रण . 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  2. 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर 8 एम यूरिया समाधान और अपकेंद्रित्र के 200 μl के साथ ध्यान केंद्रित पतला.
  3. 1 मिनट के लिए फिल्टर और भंवर में ध्यान केंद्रित करने के लिए 8 एम यूरिया के घोल में 10x आई ए ए के 10 μl जोड़ें. अंधेरे में आरटी पर 20 मिनट के लिए स्पिन फिल्टर सेते हैं तो 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  4. 8 एम यूरिया सोल के 100 μl जोड़ें15 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र पर ध्यान केंद्रित करने ution. इस कदम 2x दोहराएँ. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र के लिए 100 मिमी एबीसी समाधान के 100 μl जोड़ें. इस कदम 2x दोहराएँ.
  5. एक 1:50 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) एंजाइम से प्रोटीन अनुपात में endoproteinase lysC की 0.1 ग्राम / μl जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते
  6. ऊष्मायन के बाद, 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र के लिए 100 मिमी एबीसी समाधान के 40 μl जोड़ें. इस कदम 1x दोहराएँ.
  7. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर स्पिन फिल्टर और अपकेंद्रित्र के लिए 0.5 एम NaCl समाधान के 50 μl जोड़ें. एक ताजा microtube को lysC पेप्टाइड्स युक्त छानना स्थानांतरण और पाचन को रोकने के लिए 1.0% के लिए एफए के साथ खटास लाना.
  8. 8 एम यूरिया की 40 μl के साथ फिल्टर यूनिट धो लें, और फिर 40 μl 18 MΩ पानी के साथ 2x धो लो.
  9. 50 मिमी एबीसी समाधान के 100 μl के साथ फिल्टर यूनिट 3x धो लें. अंतिम धोने में trypsin के 0.4 माइक्रोग्राम / μl जोड़ने के बाद 1:100 एंजाइम से समर्थकTein अनुपात और 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते
  10. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र को 50 मिमी एबीसी समाधान के 40 μl जोड़कर tryptic पेप्टाइड्स Elute. इस कदम 1x दोहराएँ.
  11. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र के लिए 0.5 एम NaCl समाधान के 50 μl जोड़ें. एक ताजा microtube को tryptic पेप्टाइड्स युक्त छानना स्थानांतरण और 1.0% एफए के साथ खटास लाना.
  12. नमूना मानक के रूप में बीएसए के साथ microplate वर्णमिति परख का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

4. स्पिन स्तंभों का उपयोग desalting पेप्टाइड्स

  1. 1 मिनट के लिए 1100 XG पर acetonitrile (ACN) और अपकेंद्रित्र के 500 μl जोड़कर एक सी 18 MacroSpin स्तंभ को सक्रिय करें. Centrifugation के बाद प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
  2. 1 मिनट के लिए 1100 XG पर 0.1% एफए और अपकेंद्रित्र के 500 μl के साथ स्तंभ संतुलित करना. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और इस कदम 1x दोहराएँ.
  3. पेप्टाइड के 500 μl जोड़ने के ऊपर स्तंभ एक को पचाने1 मिनट के लिए 1100 XG पर डी अपकेंद्रित्र. नमूना मात्रा 500 μl से अधिक है, तो इस चरण को दोहराएँ.
  4. 1 मिनट के लिए 1100 XG पर 500 0.1% एफए के μl और अपकेंद्रित्र के साथ स्तंभ धो लें. प्रवाह के माध्यम से त्यागें. इस कदम 1x दोहराएँ.
  5. 1 मिनट के लिए 1100 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र एक 90:10 ACN से पानी अनुपात के 250 μl जोड़ें. Desalted पेप्टाइड्स युक्त eluent लीजिए और एक ताजा microtube को हस्तांतरण. इस कदम 1x दोहराएँ.
  6. एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में desalted पेप्टाइड नमूना सूखी और पूरी तरह से नमूना ड्राई देने से बचें.

5. आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी

  1. पेप्टाइड्स अलग करने के लिए एक 200 x 2.1 मिमी, 5 माइक्रोन SCX स्तंभ (Polysulfoethyl ए) पर पचा प्रोटीन नमूना के 50-100 ग्राम इंजेक्षन.
  2. 250 μl / मिनट की एक प्रवाह दर के साथ 50 मिनट से अधिक 2-40% बी के एक ढाल का प्रयोग करें. सॉल्वेंट एक 5 मिमी अमोनियम formate, 25% acetonitrile में पीएच 3.0 और 75% DDH 2 ओ है सॉल्वेंट बी 500 मिमी अमोनियम formate, पीएच है6.0 25 में% ACN और 75% DDH 2 ओ
  3. 280 एनएम पर पेप्टाइड भिन्न मॉनिटर और एक अंश कलेक्टर का उपयोग कर 2 मिनट के अंतराल में भिन्न इकट्ठा.
  4. नमक हटाने के साथ सहायता के लिए 5% एफए युक्त DDH 2 ओ में 50% acetonitrile के 500 μl में एक शून्य concentrator और resuspend में सूखी भिन्न.
  5. -80 डिग्री सेल्सियस पर Redry भिन्न और दुकान नैनो LC-MS/MS विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक.

6. एसीटोन वर्षा

पिछले GELFrEE जुदाई को कर्णावत प्रोटीन सतह पर तैरनेवाला desalted हो गया है. एसीटोन वर्षा प्रोटीन फीका बनाना और ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. कर्णावत सतह पर तैरनेवाला को ठंडा एसीटोन के तीन खंडों में जोड़ें. धीरे भंवर और -20 डिग्री सीओ / एन सेते
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 XG पर नमूना मिश्रण अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  3. 4 में 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर ठंडा एसीटोन और अपकेंद्रित्र के साथ प्रोटीन गोली 3x धो लेंडिग्री सेल्सियस
  4. गोली हवा शुष्क और 18 MΩ पानी के 112 μl में भंग.
  5. Microplate वर्णमिति परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.

7. कर्णावत संवेदी उपकला की GELFrEE Fractionation

  1. 5x नमूना बफर के 30 μl जोड़ें (0.25 एम Tris-एचसीएल 6.8 पीएच, 10% (w / v) एसडीएस, 50% ग्लिसरॉल, 0.5% (w / v) bromophenol नीला) 18 MΩ के 112 μl में निलंबित desalted प्रोटीन को पानी.
  2. प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड बांड को कम करने के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 8 1M डीटीटी के μl और गर्मी जोड़ें. गर्म करने के बाद कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति.
  3. एनोड जलाशय के लिए बफर चलाने का 8 मिलीग्राम, संग्रह कक्ष नमूने के लिए चल बफर के 150 μl, और कैथोड जलाशय में चल बफर के 6 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. एक पिपेट का उपयोग नमूना लोडिंग कक्ष में प्रवाहित हो सकता है कि किसी भी बफर निकालें.
  5. कर्णावत प्रोटीन मिश्रण का लोड 150 μl (≤ 1 मिलीग्राम), नमूना लोडिंग चेंबर में एक 8% टी.आर. का उपयोग3.5-150 केडीए के एक बड़े पैमाने पर सीमा के साथ कारतूस एसीटेट है.
  6. रन शुरू करने के लिए लोअर इलेक्ट्रोड और करीब साधन ढक्कन.
  7. साधन पर पहले रोका गया उस समय कैथोड जलाशय में चल बफर के 2 एमएल जोड़ने और रन को फिर से शुरू.
  8. साधन पर प्रत्येक रुका हुआ अंतराल पर, एक पिपेट का उपयोग नमूना संग्रह कक्ष से नमूना इकट्ठा करने और एक नया लेबल microtube में जोड़ें. चल बफर के 150 μl के साथ संग्रह कक्ष 2x धो लें और त्यागें.
  9. नमूना संग्रह कक्ष के लिए नए सिरे से चल रहा है बफर के 150 μl जोड़ें और चलाने फिर से शुरू. 150 μl / अंश की कुल मात्रा में 2.6 घंटे की एक समय अवधि में प्रोटीन भिन्न लीजिए.

8. GELFrEE भागों के 1D जेल वैद्युतकणसंचलन

-1 डी जेल वैद्युतकणसंचलन पूर्व enzymatic पाचन और एमएस विश्लेषण करने GELFrEE विभाजन से परिणाम कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. GELFrEE प्रोटीन भिन्न एक 4-15% Tris-एचसीएल जेल पर अलग किया जा सकता है.

  • (नमूना बफर में 350 मिमी डीटीटी) नमूना गिराए बफर के 5 μl के साथ प्रत्येक GELFrEE अंश के 5 μl विभाज्य मिलाएं.
  • 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी नमूने.
  • आरटी शांत करने के नमूनों.
  • व्यक्तिगत जेल गलियों और अंतिम अप्रयुक्त लेन में आणविक वजन मानक के लोड 5 μl में प्रत्येक GELFrEE अंश का लोड 10 μl.
  • डाई सामने जेल के नीचे तक पहुँच जाता है जब तक 1.5 घंटे के लिए 125 वी पर जेल चला या.
  • ध्यान से जेल हटाने और प्रोटीन जुदाई कल्पना करने के लिए रजत दाग प्लस के साथ दाग.

    • 9. FASP का प्रयोग GELFrEE भागों के प्रोटीन पाचन

    एक संशोधित FASP प्रक्रिया GELFrEE अंशों की डिटर्जेंट हटाने और पाचन के लिए प्रयोग किया जाता है.

    1. 8 एम Tris-एचसीएल में यूरिया और 25 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र के 200 μl के साथ मिश्रण, सीधे एक 30K फिल्टर यूनिट के लिए प्रत्येक व्यक्ति के अंश जोड़ें.
    2. यूरिया समाधान के 200 μl के साथ ध्यान केंद्रित पतलाऔर 12 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र. इस कदम 1x दोहराएँ.
    3. प्रत्येक फिल्टर यूनिट, 1 मिनट के लिए भंवर में ध्यान केंद्रित करने के लिए यूरिया के घोल में 10x आई ए ए के 10 μl जोड़ें, और अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    4. 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर इकाइयों और अपकेंद्रित्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए यूरिया समाधान के 100 μl जोड़ें. इस कदम 2x दोहराएँ. फिल्टर इकाइयों और 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र 100 मिमी एबीसी समाधान के 100 μl जोड़ें. इस कदम 2x दोहराएँ.
    5. फिल्टर इकाइयों के लिए एक 1:50 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) एंजाइम से प्रोटीन अनुपात के लिए lysC की 0.1 ग्राम / μl जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते
    6. ऊष्मायन के बाद, 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर स्पिन फिल्टर और अपकेंद्रित्र के लिए 100 मिमी एबीसी समाधान के 40 μl जोड़ें. इस कदम 1x दोहराएँ.
    7. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर स्पिन फिल्टर और अपकेंद्रित्र के लिए 0.5 एम NaCl समाधान के 50 μl जोड़ें. एक ताजा microtube के लिए प्रत्येक स्पिन फिल्टर से lysC पेप्टाइड्स युक्त छानना स्थानांतरण और trifluoroac साथ खट्टाetic एसिड (TFA).
    8. 8 एम यूरिया की 40 μl के साथ स्पिन फिल्टर धो लें, तो 40 μl 18 MΩ पानी के साथ 2x धो लो.
    9. स्पिन फिल्टर 50 मिमी एबीसी समाधान के 100 μl के साथ 3x धो लें. अंतिम धोने के एक 1:100 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) एंजाइम से प्रोटीन अनुपात में trypsin के 0.4 माइक्रोग्राम / μl जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते बाद
    10. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर 50 मिमी एबीसी समाधान और अपकेंद्रित्र के 40 μl जोड़कर प्रत्येक फिल्टर यूनिट से tryptic पेप्टाइड्स Elute. इस कदम 1x दोहराएँ.
    11. फिल्टर इकाइयों और 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र 0.5 एम NaCl समाधान के 50 μl जोड़ें. एक ताजा microtube के लिए प्रत्येक फिल्टर यूनिट से tryptic पेप्टाइड्स युक्त छानना स्थानांतरण और TFA साथ खट्टा करना.
    12. एक शून्य concentrator में सब हज़म सूखी.

    10. LC-MS/MS के लिए नमूना तैयार

    1. Reconstitute सूखे lysC और tryptic पेप्टाइड 0.1% एफए और भंवर के 20 μl में भिन्न हज़म.
    2. 10 के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूनेमिनट और एक नया नमूना शीशी को नमूना के शीर्ष 95% हटा दें.
    3. लवण और contaminants को हटाने और एक 75 माइक्रोन × 10 सेमी 18 सी स्तंभ पर chromatographic जुदाई प्रदर्शन करने के लिए एक 100 मीटर x 25 मिमी नमूना जाल पर प्रत्येक पेप्टाइड अंश के 5 μl इंजेक्षन.
    4. 200 NL / मिनट की एक प्रवाह दर के साथ 100 मिनट से अधिक 2-40% बी के एक ढाल का प्रयोग करें. सॉल्वेंट में एक 95% ddH2O और 0.1% एफए युक्त 5% acetonitrile है. सॉल्वेंट बी 80% ACN और 0.1% एफए युक्त 20% ddH2O है.
    5. प्रत्येक एमएस एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर पर स्कैन के लिए दस मिलकर जन स्पेक्ट्रा लीजिए. एक LTQ Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था.

    11. प्रोटीन की पहचान

    1. दोनों आगे युक्त UniProt माउस डेटाबेस का उपयोग प्रोटीन की पहचान और प्रोटीन दृश्यों और आम contaminants रिवर्स. शुभंकर खोज इंजन के साथ MaxQuant सॉफ्टवेयर प्रोटीन डेटाबेस खोज करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    2. इस्तेमाल किया जा सकता है कि खोज मापदंडों में शामिल हैं, तय modificसिस्टीन की carbamidomethyl की व्यावहारिक, methionine के ऑक्सीकरण की चर संशोधनों, प्रोटीन एन टर्मिनल एसिटिलीकरण, 2 की अधिकतम दरार याद किया. पहचान के लिए विचार करने के लिए न्यूनतम पेप्टाइड लंबाई 6 एमिनो एसिड है. ± 8 पीपीएम और 1.2 दा (जन त्रुटि मास स्पेक्ट्रोमीटर का इस्तेमाल किया जा रहा है पर निर्भर है) का एक टुकड़ा जन सहिष्णुता की एक पेप्टाइड जन एकाग्रता त्रुटि लिखें.
    3. MaxQuant सॉफ्टवेयर में, पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान के लिए एक 1% झूठे खोज दर (एफडीआर) का उपयोग करें. प्रोटीन की पहचान मिलान किया पेप्टाइड्स प्रतिशत प्रोटीन अनुक्रम कवरेज, और पेप्टाइड दृश्यों की संख्या के साथ सूचीबद्ध है.

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    Representative Results

    कर्णावत संवेदी उपकला की सबसे व्यापक proteome प्राप्त करने के लिए, त्वरित ऊतक विच्छेदन पूर्व प्रोटीन निष्कर्षण और नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक है. दो प्रोटिओमिक तकनीक, बन्दूक और नीचे अप प्रोटिओमिक्स इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 1 में सचित्र रूप में बन्दूक प्रोटिओमिक्स के लिए नमूने तैयार करने के लिए, FASP पाचन प्रक्रिया का इस्तेमाल किया गया था. FASP विधि प्रोटीन की एकाग्रता, डिटर्जेंट को हटाने, और कई एंजाइमों का उपयोग प्रोटीन के पाचन के लिए अनुमति देता है. पहला, जमा 18 भागों में एक SCX स्तंभ पर fractionated और नैनो LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण किया गया जो trypsin के साथ एक दूसरे पाचन, इसके बाद tryptic पाचन था इस्तेमाल किया दो डबल पाचन प्रक्रिया, वहाँ थे. इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर एक भी रन LC-MS/MS जब प्रदर्शन 1,485 प्रोटीन के कुल एक 1% एफडीआर के साथ पहचान की गई. पहचान प्रोटीन के अलावा, 329 और 258 प्रोटीन (चित्रा क्रमशः, माइटोकांड्रिया और प्लाज्मा झिल्ली में वर्गीकृत किया गया2A). दूसरी डबल पाचन प्रक्रिया trypsin पाचन द्वारा पीछा lysC पाचन शामिल थे. प्रत्येक डाइजेस्ट व्यक्तिगत रूप से भरी हुई है और SCX स्तंभ पर अलग 18 भागों में और नैनो LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण किया गया था. lysC और trypsin digestions का परिणाम एक 1% एफडीआर. चित्रा 2B के साथ 3,503 प्रोटीन का कुल उत्पादन 605 और 617 प्रोटीन, क्रमशः माइटोकांड्रिया और प्लाज्मा झिल्ली में वर्गीकृत किया गया है दिखाता है. यह दृष्टिकोण झिल्ली जुड़े प्रोटीन आईडी की सबसे बड़ी संख्या प्रदान की. LysC और trypsin अंशों की डुप्लिकेट विश्लेषण पहचान प्रोटीन की 65% से अधिक प्रयोगों के बीच साझा किया गया पता चला. हालांकि, दोहराने के विश्लेषण में नव पहचान प्रोटीन भी वहाँ थे. अतिरिक्त पेप्टाइड और प्रोटीन इसलिए विखंडन 25 के लिए अलग पेप्टाइड्स के लिए अग्रणी कारण क्रोमैटोग्राफी में छोटे बदलाव करने के लिए पहचान की गई.

    नीचे अप प्रोटिओमिक्स GELFrEE विभाजन का उपयोग कर लागू किया गया थाचित्रा 3 में सचित्र रूप LC-MS/MS करने से पहले. एकत्र 12 GELFrEE भिन्न थे. पिछले पाचन और LC-MS/MS विश्लेषण करने के लिए, एक चांदी से सना हुआ जेल 4 चित्र में सचित्र रूप GELFrEE विभाजन से परिणाम कल्पना करने के लिए तैयार किया गया था. जेल प्रत्येक लगातार अंश के लिए आणविक वजन में वृद्धि से प्रोटीन जुदाई दिखाया. इसलिए, 12 GELFrEE तरल भिन्न दो अलग बहु FASP पाचन दृष्टिकोण का उपयोग कर पचा और LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण किया गया. पहली पाचन दृष्टिकोण एक भी रन LC-MS/MS जब प्रदर्शन एक 1% एफडीआर के साथ 2165 प्रोटीन की पहचान करने के लिए नेतृत्व जो एक डबल trypsin पाचन, उपयोग किया गया था. चित्रा 5A से पता चलता है कि वहाँ 516 थे और 399 प्रोटीन माइटोकांड्रिया में वर्गीकृत किया है कि और प्लाज्मा झिल्ली, क्रमशः. दूसरी पाचन दृष्टिकोण trypsin पाचन द्वारा पीछा endoproteinase lysC उपयोग किया गया था. एकल रन LC-MS/MS विश्लेषण एक 1% एफडीआर के साथ 2,211 प्रोटीन की पहचान की. यहदृष्टिकोण trypsin / trypsin दृष्टिकोण (चित्रा 5 ब) का उपयोग कर के रूप में जब झिल्ली जुड़े प्रोटीन की एक समान संख्या दिखाया. मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स डेटा डेटा सेट पहचानकर्ता PXD000231 25 के साथ ProteomeXchange कंसोर्टियम 26 को जमा किया गया है. विभिन्न तकनीकों से परिणाम माउस कोक्लीअ संवेदी उपकला (चित्रा 6) से झिल्ली और घुलनशील प्रोटीन की एक बड़ी संख्या में हुई संयोजन.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. FASP, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, और उच्च संकल्प एमएस का उपयोग कर एक बन्दूक प्रोटिओमिक प्रयोग के योजनाबद्ध. प्रोटीन, निकाले solubilized, और lysC और trypsin endoproteinases साथ FASP का उपयोग कर पचा रहे हैं. LysC (हरी ट्यूब) और tryptic पेप्टाइड्स (बैंगनी ट्यूब) SCX क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कम जटिल भागों में विभाजित है और नैनो LC-MS/MS का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. शुभंकर खोज इंजन प्रोटीन की पहचान के लिए एमएस डेटा की प्रक्रिया करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 2
    SCX जुदाई और SCX जुदाई द्वारा पीछा trypsin के साथ एक दूसरे पाचन द्वारा पीछा lysC (ख) प्रथम पाचन द्वारा पीछा trypsin के साथ एक (ए) पहले और दूसरे पाचन जब प्रदर्शन चित्रा 2. प्रोटीन आईडी की सेलुलर घटकों प्रोफाइल GO. सभी श्रेणियों में गिना जाता है nonexclusively, एक प्रोटीन सेलुलर घटकों के लिए एक से अधिक श्रेणी की है.es.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. GELFrEE, FASP, और उच्च संकल्प एमएस का उपयोग कर एक नीचे अप प्रोटिओमिक प्रयोग के योजनाबद्ध. निकाले प्रोटीन solubilized हैं और प्रोटीन lysate से लवण और अवांछित को दूर करने के एसीटोन (ब्लू ट्यूब) का उपयोग उपजी हैं. प्रोटीन गोली solubilized है और प्रोटीन GELFrEE का उपयोग fractionated. प्रत्येक अंश lysC और trypsin endoproteinases साथ FASP का उपयोग कर पचा गया था. LysC प्रत्येक अंश शुभंकर का उपयोग एमएस डेटा खोज के द्वारा की पहचान की नैनो LC-MS/MS और प्रोटीन का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं से हरे (ट्यूब) और tryptic पेप्टाइड्स (बैंगनी ट्यूब). बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें आर छवि.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. पूर्व एमएस विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक अंश में प्रोटीन जुदाई कल्पना करने कर्णावत संवेदी उपकला GELFrEE अंश का रजत दाग जेल. (एम) प्रोटीन मार्कर, (1) अंश 1, (3) अंश 2, (5) अंश 5, (7) अंश 7, (8) अंश 8, (9) भिन्न 9, (10) अंश 10, (11) अंश 11, (12) अंश 12. Darville और Sokolowski 24 से अनुमति के साथ (अनुकूलित) पुनर्प्रकाशित. अमेरिकन केमिकल सोसायटी द्वारा कॉपीराइट 2013. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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    चित्रा 5. GELFrEE जुदाई और GELFrEE जुदाई के बाद trypsin के साथ एक दूसरे पाचन द्वारा पीछा lysC (ख) प्रथम पाचन के बाद trypsin के साथ पहले और दूसरे पाचन एक (ए) जब प्रदर्शन प्रोटीन आईडी की सेलुलर घटकों प्रोफाइल GO. सभी श्रेणियों nonexclusively गिने जाते हैं, एक प्रोटीन सेलुलर घटकों के लिए एक से अधिक श्रेणी की है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 6
    चित्रा 6. SCX, मोम, या GELFrEE जुदाई का उपयोग पहचान सभी प्रोटीन के लिए सेलुलर घटकों प्रोफाइल जाओ. एक प्रोटीन सेलुलर घटकों के लिए एक से अधिक वर्ग, अपने categorie के सभी था जबएस nonexclusively गिना रहे थे. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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    Discussion

    कर्णावत संवेदी उपकला से प्रोटीन की पहचान के लाभ के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: पाचन के लिए कई endoproteinases 1) का प्रयोग करें, कई जुदाई तकनीक के 2) का प्रयोग करें, और एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर के 3) उपयोग. कई एंजाइमों के आवेदन पेप्टाइड्स की संख्या बढ़ जाती है और प्रोटीन अनुक्रम कवरेज को बेहतर बनाता है, इसलिए कर्णावत ऊतक से पहचान प्रोटीन की संख्या में सुधार. Trypsin, सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रोटीज एमएस आयनीकरण और विखंडन के लिए अच्छा कर रहे हैं कि पेप्टाइड्स पैदा करने, प्रोटीन के कुशल और विशिष्ट दरार प्रदान करता है. हालांकि, इस तरह के और अधिक कुशल पेप्टाइड दरार प्रदान करता लाइसिन अवशेषों में भी जो cleaves, lysC, के रूप में पूर्व trypsin के लिए एक और एंजाइम, का उपयोग कर. यह lysC / trypsin पाचन से उत्पन्न प्रोटीन के अनुक्रम कवरेज trypsin / trypsin डाइजेस्ट से प्रोटीन अनुक्रम कवरेज के लिए प्रोटीन अनुक्रम कवरेज सापेक्ष में वृद्धि देखी गई है कि मनाया गया.

    "ove_content> पूर्व एमएस करने के लिए बहुआयामी जुदाई का कार्यान्वयन बन्दूक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण में उच्च कर्णावत नमूना जटिलता कम कर दिया. इस की पहचान करने के लिए आम तौर पर मुश्किल हो जाता है जो झिल्ली प्रोटीन सहित अधिक प्रोटीन,, की पहचान के लिए अनुमति दी. झिल्ली प्रोटीन की एक बड़ी संख्या का उपयोग कर पहचाना गया नीचे अप दृष्टिकोण करने के लिए विरोध के रूप में बन्दूक दृष्टिकोण. हालांकि, अधिक कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति दी GELFrEE का उपयोग कर नीचे अप दृष्टिकोण. इस तरह के कोक्लीअ से, व्यक्ति में cochlin के रूप में अधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन, के अलगाव की वजह से है भिन्न.

    इस तरह के एक LTQ-Orbitrap, सुधार और कोक्लीअ में पहचाना जा सकता है कि प्रोटीन की संख्या बढ़ जाती है के रूप में एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर, द्वारा वर्तमान प्रोटोकॉल में हासिल की उच्च गुणवत्ता वाले डेटा. LTQ-Orbitrap उच्च संकल्प, उच्च जन सटीकता, और पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है. इस यंत्र enab की इसलिए आवेदनलेस ऐसे कर्णावत संवेदी उपकला के रूप में जटिल जैविक नमूने से प्रोटीन की पहचान और कम प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड्स की पहचान बनती है. एमएस के शक्तिशाली उपकरण के साथ इन संयुक्त प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की उपयोगिता काफी इसलिए सुनवाई और बहरापन में शामिल उपन्यास प्रोटीन biomarkers की पहचान करने के लिए अवसर में सुधार, कर्णावत प्रोटीन डाटासेट में वृद्धि करने में मदद करता है.

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    Disclosures

    लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा.

    Acknowledgments

    इस लेखक डॉ. कैंट Seeley, इस सुविधा के उपयोग के लिए दक्षिण फ्लोरिडा विश्वविद्यालय में ड्रग डिस्कवरी और अभिनव के लिए केंद्र (CDDI) प्रोटिओमिक्स कोर सुविधा के निदेशक धन्यवाद. इस काम BHAS लिए एनआईएच / NIDCD अनुदान R01 DC004295 द्वारा समर्थित किया गया

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

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    References

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    बायोकैमिस्ट्री अंक 85 कर्णावत क्रोमैटोग्राफी LC-MS/MS मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स संवेदी उपकला
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    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

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