Summary
막 단백질을 분리하고 식별하기 어렵 기 때문에 인공 감각 상피 세포의 프로테옴 분석 인해 작은 크기와에 도전하실 수 있습니다. 막과 용해성 단백질 모두 고해상도 질량 분석법과 함께 체류 분취 방법 및 분리 기술을 조합하여 식별 될 수있다.
Abstract
단백질 체학은 복잡한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 일반적으로 사용되는 방법입니다. 인공 감각 상피 세포는 말초 및 중추 신경 시스템에 의해 처리 전기 화학 에너지로 소리의 기계적 에너지를 형질 도입 수용체가 포함되어 있습니다. 여러 프로테오믹스 기술은 두 가지 차원의 차이 겔 전기 영동 (2D-DIGE), 항체 마이크로 어레이 및 질량 분석 (MS)와 같은 인공 내이 (内耳)를 연구하기 위해 개발되었다. MS는 단백질 체학에서 가장 포괄적이고 다양한 도구와 분리 방법과 함께 생체 시료에 대한 심층적 인 프로테옴을 제공 할 수 있습니다. MS와 결합 분리 방법은, 단백질 시료를 농축 저분자 및 소수성 단백질을 검출하고 프로테옴 동적 범위를 감소시킴으로써 낮은 풍부한 단백질을 식별 할 능력이있다. 다른 소화 전략은 펩티드 및 단백질 바로 전체 용해질 또는 분획 된 단백질 용 해물을 적용 할 수있다시퀀스 범위. 강한 양이온 교환 (SCX), 역상 (RP) 및 겔 용출 액체 분획 포착 전기 영동 (GELFrEE) 등 다른 분리 기술의 이용은 단백질 식별 전에 MS 분석으로 샘플의 복잡성을 줄이기 위해 적용될 수있다.
Introduction
단백질 체학은 단백질 발현, 기능, 수정 및 상호 작용 1을 분석하여 복잡한 생물학적 시스템의 연구이다. 여러 가지 방법 항체 마이크로 어레이 2, 이차원 전기 영동 3-5 및 DIGE 6 등의 내이 (内耳)의 프로테옴 분석에 이용되어왔다. 그러나, 단백질의 단지 제한된 수의 확인 된 및 내이 11,12에서 식별 10,000 이상의 유전자 발현 서열 태그 (EST를)에 비해 2,7-10을 특징으로, MS는 가장 일반적으로 사용되는 기술이다 포괄적 단백질 특성 분석을위한 단백질 체학에서. 같은 달팽이관과 같은 복잡한 단백질체 시료의 분석, 도전하실 수 있습니다. 그러나, MS와 여러 분리 기술의 조합으로 인해 증가 된 동적 농도 범위 및 최대 용량 (13)에, 펩티드 및 단백질의 더 큰 개수의 식별을 가능하게한다. 다차원 chromatograPHY는 상이한 흡착 메카니즘의 사용을 허용하여 매우 복잡한 단백질 혼합물을 감소시킨다. 두 일반적으로 사용되는 MS 프로테옴 분석 방법, 산탄 총과 상향식 (bottom-up) 단백질 체학이 있습니다. 샷건 프로테오믹스에서 그대로 단백질의 혼합물 효소 소화 강한 양이온 교환 크로마토 그래피 역상 액체 크로마토 그래피 (RPLC) 14, 15 다음에 (SCX)와 다차원 크로마토 그래피를 이용하여 분리된다. 분리 된 펩티드는 탠덤 MS의 대상 및 데이터베이스 (15)를 찾고 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 단백질 수천 번의 분석으로 식별 될 수 있고, 기술은 막 단백질에 더 적합하다는 것이다.
상향식 접근법에서, 단백질 혼합물은 보통 하나 또는 이차원 전기 영동으로 분리하고, 각각의 단백질 밴드 또는 스폿은 대개 여러 펩티드의 결과, 트립신과 같은 효소로 잘라 소화. 그러나, 또 다른 최근의LY는 상향식 (bottom-up) 단백질 체학에 사용, 전기 접근 방식을 개발, GELFrEE입니다. 이 기술은 액상 단백질 샘플을 fractionates 전에 분석하기가 덜 복잡합니다. 이 기술은, 재현성 높은 단백질 복구를 제공하고, 복합 단백질 시료 (16)에서 높은 풍부한 단백질의 분포를 감소시킨다. 분리 된 단백질로부터 생성 된 펩티드, 데이터베이스는 17-19을 검색하기위한 태그 서열을 생성하기 위해, 펩티드 질량 지문 또는 탠덤 MS (MS / MS)를 사용하여, MS에 의해 분석된다. 상향식 접근법을 사용의 주요 이점 중 일부는 고해상도 분리 및 단백질의 광범위한 커버리지를 획득 할 수있는 능력이다. 상향식 (bottom-up) 단백질 체학은 단백질 체학 (20)에서 가장 널리 사용되는 기술이다, 따라서, 여러 생물 정보학 도구를 사용할 수 있습니다. 또한, 단백질은 소화 전에 복잡한 혼합물에서 분리 될 수 있으므로, 식별 큰 기회가있다.
주요 과제 중 하나프로테오믹스 분석 내이 (内耳)를 사용하여 작은 크기, 제한된 접근성, 세포 유형의 다양성 (21)이다. 또, 이온 채널, 전송기 및 수용체로서의 기능을 구별 키 단백질은, (22)을 분리하기 어려울 수 멤브레인 단백질이다. 따라서, 필터 원조 샘플 준비 (FASP)은 단백질 추출을 위해 제한됩니다 조직의 단백체 분석에 유리하고 막 (23)을 용해하기 위해 세제를 필요로하는. 이러한 필터링은 막과 용해성 단백질의 MS 분석 및 저 분자량 오염물 23,24로부터 펩티드를 분리 할 수있는 능력을 허용한다.
본 프로토콜은 합하고 수용성 및 멤브레인 단백질 모두를 분석하여 인공 와우 감각 상피에서 단백질 ID의 수를 최대화하기 위해 수정되고 일반적으로 사용 프로테오믹스 방법을 설명한다. 우리는 FASP 멀티 소화와 샷건 프로테오믹스를 사용하여 설명합니다이온, 이온 교환 크로마토 그래피, 고해상 MS 및 데이터 분석. 또, GELFrEE, FASP 멀티 소화 고해상도 MS, 데이터 분석 상향식 프로테오믹스 설명한다.
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Protocol
윤리 정책
건강의 국립 연구소의 지침에 따라 명시된 마우스 조직을 사용하여 실험은 사우스 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 3931R, 3482R)에 의해 승인되었다.
1. 단백질 추출
- C. ° -80 16 30 일 이전 (P30) CBA / J 마우스 및 저장소에서 인공 감각 상피를 분리
- 실험 당일, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 500 μL와 조직을 세척 하였다. 1,000 XG에 3 분 동안 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 총 3 회 세척을 반복합니다.
- 에 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 120 mM의 NaCl을, 50 mM의 불화 나트륨, 5 mM의 EDTA, 500 ㎍ / ㎖의 AEBSF, 10 ㎍ / ㎖의 류 펩틴, 100 μg을 / 포함 용해 버퍼 100 μL에서 얼음에 30 초 동안 초음파 처리 조직 소닉 dismembrator (; 써모 피셔 모델 100)를 사용하여 펩 스타틴 ㎖, 2 ㎍ / ㎖의 아프로 티닌, 0.5 ㎍ / ㎖의 microcystin. 얼음 시원한 해물각 초음파 사이에 1 분. 배의 총 초음파 처리.
- 2 분 동안 4 ° C에서 750 XG에서 추출물을 원심 분리기 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 제거합니다. 얼음에 30 초 동안 초음파 처리에 의해 용해 완충액 50 μL에 펠렛을 추출합니다. 2 분 동안 4 ° C에서 750 XG에서 추출물을 원심 분리기. 60 분 동안 4 ° C에서 28,600 XG에 해물과 원심 분리기를 모두 결합합니다. 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 제거하고 펠릿에 0.1 % ASB-14를 포함하는 20 ㎕의 용해 버퍼를 추가합니다. 소용돌이 1 분, 4 ℃에서 60 분 동안 배양
- 60 분 동안 4 ° C에서 냉각 한 후, 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 가열한다. 10 분 동안 25 ° C에서 16,000 XG에서 원심 분리에 따릅니다. 상층 액을 수집하고 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 5 분 동안 4 ° C에서 16,000 XG에 현탁액을 원심 분리기와 소화에 뜨는을 유지합니다.
2. FASP를 사용하여 전체 해물 더블 트립 틱 단백질 소화
- 30 μ 추가4 % 도데 실 황산나트륨 (SDS)를 포함하는 인공 단백질 추출물,의 (400μg의 ≤) L 나누어지는, 100 MM 트리스 - 염산, 직접 30K 스핀 필터의 pH 7.6와 0.1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)과 8의 200 μL와 혼합 트리스 - 염산에있는 M의 요소. 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기.
- 15 분 동안 14,000 XG에 8 M의 요소 솔루션 및 원심 분리기 200 μL로 농축 물을 희석.
- 1 분에 대한 필터와 소용돌이에 집중할 8 M 요소 용액에 10 배 요오도 아세트 아미드 (IAA)의 10 μl를 추가합니다. 10 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리 어두운 실온 (RT)에서 20 분 동안 스핀 필터를 배양한다.
- 15 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에서 농축에 8 M 우레아 용액 100 μl를 추가. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 50 mM의 중탄산 암모늄 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기 (ABC) 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다.
- 1:100에서 트립신의 0.4 ㎍ / ㎕의 추가 (W / W) 효소에단백질 비율이 37 ℃에서 하룻밤 (O / N)를 배양
- 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 장치와 원심 분리기를 필터링하는 50 mM의 ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 소화를 중지 1.0 % 포름산 (FA)로 산성화.
- 8 M 요소의 40 μL와 필터 장치를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다.
- 50 mM의 ABC 용액 100 μL와 필터 유닛의 3 배를 씻으십시오. 최종 세척은 1:100 (w / w) 효소로 단백질의 비율로 트립신 0.4 ㎍ / μL를 추가하고 37 ℃에서 O / N을 배양 한 후
- 10 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 50 mM의 ABC 용액 40 μl를 첨가하여 다이제스트 번째부터 트립신 펩티드를 용출. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 1.0 %에 FA로 산성화.
- 샘플을 표준으로 BSA를 사용하여 마이크로 비색 분석을 사용하여 정량 할 수있다.
3. FASP를 사용하여 전체 해물 엔도의 lysC 및 트립 틱 단백질 소화
- 직접 30K 스핀 필터 4 % SDS, 100 MM 트리스 - 염산, pH를 7.6 및 0.1 M DTT를 포함하는 인공 단백질 추출물의 30 μL 나누어지는 (400μg의 ≤)를 추가하고 트리스 - 염산 8 M 요소의 200 μL와 혼합 . 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기.
- 15 분 동안 14,000 XG에 8 M의 요소 솔루션 및 원심 분리기 200 μL로 농축 물을 희석.
- 1 분에 대한 필터와 소용돌이에 집중할 8 M 우레아 용액에 10 배 IAA의 10 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 스핀 필터를 부화 후 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기.
- 8 M의 요소 졸 100 μl를 추가합니다15 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 집중의 ution. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다.
- 1:50 (W / W) 효소로 단백질의 비율로 엔도의 lysC 0.1 ㎍ / μl를 추가하고 30 ℃에서 O / N을 품다
- 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 신선한 모세관에의 lysC 펩타이드를 포함하는 여과 액을 전송하고 소화를 중지 1.0 %에 FA로 산성화.
- 8 M 요소의 40 μL와 필터 장치를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다.
- 50 mM의 ABC 용액 100 μL와 필터 유닛의 3 배를 씻으십시오. 최종 세척에 트립신의 0.4 ㎍ / μl를 추가 한 후 1:100 효소 - 투 - 프로TEIN 비율과 37 ℃에서 O / N을 품다
- 10 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 50 mM의 ABC 용액 40 μl를 첨가함으로써 트립신 펩티드를 용출. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 1.0 % FA로 산성화.
- 샘플은 표준으로 BSA를 가진 마이크로 비색 분석을 사용하여 정량 할 수있다.
4. 스핀의 열을 사용하여 탈염 펩티드
- 1 분 1,100 XG에서 아세토 니트릴 (ACN) 및 원심 분리기 500 μl를 추가하여 C 18 MacroSpin 열을 활성화합니다. 원심 분리 후 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 1 분 1,100 XG에서 0.1 % FA 원심 분리기 500 μL에 열을 평형. 흐름을 통해 폐기하고이 단계 1X를 반복합니다.
- 펩티드의 500 μL를 추가 열을 소화1 분 1,100 XG에 D 원심 분리기. 샘플 부피는 500 μL보다 큰 경우,이 단계를 반복한다.
- 1 분 1,100 XG에서 500 0.1 % FA ㎕의 원심 분리기와 열을 씻으십시오. 흐름을 통해 폐기하십시오. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 1 분 1,100 XG에 열 및 원심 분리기 90:10 ACN - 투 - 물 비율을 250 μl를 추가합니다. 탈염 펩타이드를 포함하는 용출액을 수집하고 새로운 마이크로 튜브로 전송할 수 있습니다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 진공 원심 분리기의 탈염 펩타이드 샘플을 건조 완전히 샘플 건조시키는 마십시오.
5. 이온 교환 크로마토 그래피
- 펩티드를 분리하는 200 X 2.1 mm, 5 μm의의 SCX 칼럼 (Polysulfoethyl A)에 소화 된 단백질 시료의 50 ~ 100 μg을 주입한다.
- 250 μL / 분의 유속으로 50 분에 걸쳐 2-40%의 B의 구배를 사용한다. 솔벤트는 5 MM의 암모늄 포름산, 25 % 아세토 니트릴의 pH 3.0 및 75 %의 DDH 2 O입니다 용매 B는 500 MM의 암모늄 포름산, 산도입니다6.0 25 %의 ACN 75 %의 DDH 2 O.
- 280 nm에서 펩티드 분수를 모니터링하고 일부 컬렉터를 사용하여 2 분 간격으로 분수를 수집합니다.
- 염 제거를 지원하기 위해 5 % FA를 포함 DDH 2 O의 50 % 아세토 니트릴 500 μL에서 진공 농축기와에 resuspend 드라이 분수.
- -80 ° C에서 Redry 분수 및 저장 나노 LC-MS/MS 분석을 위해 사용할 준비가 될 때까지.
6. 아세톤 강수량
이전 GELFrEE 분리에 인공 단백질 상층 액을 탈염해야합니다. 아세톤 침전 단백질을 탈염 및 농축 할 수있다.
- 인공 상층 액에 얼음처럼 차가운 아세톤의 세 볼륨을 추가합니다. 부드럽게 와동 -20 ° CO / N. 부화
- 4 ° C에서 15 분 동안 15,000 XG에서 샘플 혼합물을 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다.
- 4에서 5 분 동안 14,000 XG에서 냉장 아세톤 및 원심 분리기와 단백질 펠릿의 3 배를 세척° C.
- 펠렛을 건조시킨 18 MΩ 물 112 μL에 용해.
- 마이크로 비색 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
7. 달팽이 감각 상피의 GELFrEE 분별
- 5 배 샘플 버퍼 30 μl를 추가 (0.25 M 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % (W / V) SDS, 50 % 글리세롤, 0.5 % (W / V) 브롬 페놀 블루) 18 MΩ 112 μL에 현탁 탈염 단백질 물.
- 단백질 이황화 결합을 줄이기 위해 5 분 동안 95 ° C에서 8 개월 DTT ㎕의 열을 추가합니다. 가열 한 후 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
- 양극 저수지에 버퍼를 실행하는 8 ㎖, 수집 챔버를 샘플 버퍼를 실행 150 μL 및 음극 저수지에 버퍼를 실행 6 ㎖를 추가합니다.
- 피펫을 사용하여 샘플 로딩 챔버로 유입 된 수있는 버퍼를 제거합니다.
- 인공 단백질 혼합물의 하중 150 μL (≤ 1 ㎎)을, 샘플 로딩 챔버로 8 % TR을 사용3.5-150 kDa의의 질량 범위 카트리지 - 아세테이트이다.
- 실행을 시작하는 하부 전극 주변 기기의 뚜껑.
- 악기의 첫 번째 일시 정지시에 음극 저수지에 버퍼를 실행 2 ㎖를 추가하고 실행을 다시 시작합니다.
- 기기의 각 일시 정지 구간에서 피펫을 사용하여 시료 채취 실에서 샘플을 수집하고 갓 표시된 마이크로 튜브에 추가합니다. 버퍼를 실행 150 μL로 수집 챔버의 2 배를 씻어 버린다.
- 시료 채취 실에 신선한 실행 버퍼 150 μl를 추가하고 실행을 다시 시작합니다. 150 μL / 분획의 총 부피에서 2.6 시간의 기간 동안 단백질 분획을 수집한다.
8. GELFrEE 분수의 1 차원 젤 전기
1D 겔 전기 영동 전에 효소 소화와 MS 분석에 GELFrEE 분획으로부터 결과를 시각화 할 수있다. GELFrEE 단백질 분획 4-15% 트리스 - 염산 겔상에서 분리 될 수있다.
9. FASP 사용 GELFrEE 분획의 단백질 소화
변성 FASP 절차 GELFrEE 분획 세제 제거 및 분해하는 데 사용된다.
- 8 M 트리스 - 염산의 요소와 25 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기 200 μL와 혼합, 직접 30K 필터 장치에 각각의 부분을 추가합니다.
- 요소 용액 200 μL로 농축 물을 희석12 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 각 필터 유닛, 1 분 동안 소용돌이에 집중하는 요소 용액에 10 배 IAA의 10 μl를 추가하고, 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 15 분 동안 14,000 XG에 필터 유닛 및 원심 분리기에서 농축에 우레아 용액 100 μl를 추가. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 필터 유닛과 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다.
- 필터 유닛에 1:50 (W / W) 효소에 단백질 비율로하여 lysC 0.1 ㎍ / μl를 추가하고 30 ℃에서 O / N을 품다
- 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 각 스핀 필터에서의 lysC 펩타이드를 포함하는 여과 액을 전송하고 trifluoroac으로 산성화ETIC 산 (TFA).
- 8 M 요소의 40 μL와 스핀 필터를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다.
- 스핀 필터는 50 mM의 ABC 용액 100 ㎕ 씩 3 배 씻으십시오. 최종 세척은 1:100 (w / w) 효소로 단백질의 비율로 트립신 0.4 ㎍ / μL를 추가하고 37 ℃에서 O / N을 배양 한 후
- 10 분 동안 14,000 XG에 50 mM의 ABC 솔루션 및 원심 분리기의 40 μl를 추가하여 각각의 필터 유닛에서 트립신 펩티드를 용출한다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
- 필터 유닛과 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 신선한 모세관에 각 필터 유닛에서 트립신 펩티드를 함유하는 여액을 전송하고 TFA로 산성화.
- 진공 농축기에서 모두 소화 건조.
10. LC-MS/MS의 샘플 준비
- 재구성 건조의 lysC 및 트립 틱 펩타이드는 0.1 % FA와 소용돌이 20 ㎕에 분수를 소화.
- 10 20,000 XG에 원심 분리기 샘플분하고 새로운 샘플의 유리 병에 시료의 최고 95 %를 제거합니다.
- 염 및 오염 물질을 제거하고 75 μm의 × 10cm의 C 18 컬럼 크로마토 그래피 분리를 수행하기 위해 100 μm의 X 25mm 샘플 트랩에 펩타이드 분획의 5 μl를 주입한다.
- 200 NL / 분의 유속으로 100 분에 걸쳐 2-40%의 B의 구배를 사용한다. 용매는 95 % ddH2O 0.1 % FA를 함유 5 % 아세토 니트릴이다. 용매 B는 80 % ACN 0.1 % FA를 포함하는 20 % ddH2O입니다.
- 각 MS는 고해상도 질량 분석기에 스캔 열 텐덤 질량 스펙트럼을 수집한다. LTQ Orbitrap 질량 분석기는이 실험에 사용 하였다.
11. 단백질 확인
- 포워드 포함 UniProt의 마우스 데이터베이스를 사용하여 단백질을 확인하고 단백질 서열 및 일반 오염 물질을 역. 마스코트의 검색 엔진 MaxQuant 소프트웨어는 단백질 데이터베이스를 검색하는 데 사용됩니다.
- 사용할 수있는 검색 매개 변수를 포함, 고정 modific시스테인의 carbamidomethyl의 ATION는 메티오닌 산화 변수 수정, 단백질의 N-말단 아세틸 화, 2의 최대 분열을 놓쳤다. 식별을 위해 고려해야 할 최소 펩타이드 길이는 6 아미노산이다. ± 13 ppm으로 1.2 다 (질량 오류가 질량 분석기가 사용되는에 따라 달라집니다)의 조각 대량 관용의 펩티드 질량 농도의 오류를 입력합니다.
- MaxQuant 소프트웨어에서, 펩타이드 및 단백질 식별을위한 1 %의 거짓 발견 속도 (FDR)를 사용합니다. 단백질 식별은 유사한 펩티드 %의 단백질 서열에 따르면, 펩티드 서열의 개수와 함께 나열된다.
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Representative Results
인공 감각 상피의 가장 포괄적 인 프로테옴를 얻으려면 빠른 조직 절개 전에 단백질 추출 및 샘플 준비에 필요합니다. 두 프로테옴 기법, 산탄 및 상향식 프로테오믹스를 사용할 수있다. 도 1에 도시 된 바와 같이 샷건 프로테오믹스를위한 샘플을 준비하기 위해 FASP 분해 절차가 사용되었다. FASP 방법은 단백질의 농도, 세제의 제거, 여러 효소를 사용하여 단백질의 소화를 할 수 있습니다. 첫 번째는, 합동 18 분수에 SCX 칼럼에 분획 나노 LC-MS/MS 분석 하였다 트립신 두 번째 소화, 다음에 트립신 소화했다 사용되는 두 배의 소화 과정이 있었다. 본 실험 방법을 사용하여 단일 실행 LC-MS/MS를 수행 할 때 1,485 단백질의 총 1 % FDR로 확인되었다. 확인 된 단백질 중, 329 및 258 단백질 (그림 각각 미토콘드리아 플라즈마 막에 분류되었다2A). 두 번째 더블 소화 절차는 트립신 소화 다음의 lysC 소화으로 구성되었다. 각 다이제스트 개별적로드 SCX 컬럼상에서 분리 된 분획 (18)에 나노 LC-MS/MS에 의해 분석 하였다. 의 lysC 및 트립신 digestions의 결과는 1 % FDR.도 2B와 3503 단백질의 총 생산 605 및 617는 각각 단백질, 미토콘드리아 및 세포막으로 분류 된 것을 보여준다. 이 접근법은 막 - 관련 단백질 ID의 최대 개수를 제공 하였다. 의 lysC 및 트립신 분수의 중복 분석은 확인 된 단백질의 65 % 이상이 실험 사이에 공유 된 보였다. 그러나 복제 분석에서 새로 확인 된 단백질도있었습니다. 추가 펩타이드 및 단백질 따라서 조각 (25)에 대해 서로 다른 펩티드로 이어지는 인해 크로마토 그래피의 작은 변화로 확인되었다.
상향식 (bottom-up) 단백질 체학은 GELFrEE 분별을 사용하여 적용도 3에 도시 된 바와 같이, LC-MS/MS에 앞서. 수집 된 12 GELFrEE 분수가 있었다. 종래 소화 LC-MS/MS 분석에 실버 염색 겔은도 4에 도시 된 바와 같이 GELFrEE 분획으로부터 결과를 시각화를 제조 하였다. 겔은 연속 된 각 분획에 대한 분자량의 증가에 의해 단백질을 분리 하였다. 따라서 12 GELFrEE 액체 분획이 서로 다른 멀티 FASP 소화 방법을 사용하여 소화 LC-MS/MS로 분석 하였다. 첫 번째 소화 방식이 단일 실행 LC-MS/MS를 수행 할 때 1 %의 루즈 벨트와 2,165 단백질의 식별에지도 더블 트립신 소화를 사용하여 수행 하였다. 그림 (a)는 표시가 516이었다 399 단백질은 미토콘드리아로 분류하는 것이 및 세포막였다. 제 소화 접근은 트립신 소화 하였다 엔도의 lysC를 사용하여 실시 하였다. 단일 실행 LC-MS/MS 분석은 1 % FDR과 2,211 단백질을 확인했다. 이접근법은 트립신 / 트립신 접근법 (도 5B)를 사용하는 경우와 같이 막 - 관련 단백질의 유사한 개수를 보였다. 질량 분광법 프로테오믹스 데이터는 데이터 세트 식별자 PXD000231 (25) ProteomeXchange 컨소시엄 (26)로 증착되었다. 다른 기술에서의 결과는 마우스 달팽이관 감각 상피 (도 6)까지 막과 용해성 단백질의 다수의 결과를 결합하는.
도 1. FASP, 이온 교환 크로마토 그래피, 및 고해상도를 사용 MS 산탄 단백체 실험의 도식. 단백질 추출 가용화와의 lysC 및 트립신 endoproteinases로 FASP를 사용 소화된다. 의 lysC (녹색 튜브) 및 트립 틱 펩타이드 (보라색 튜브) SCX 크로마토 그래피를 사용하여 덜 복잡한 분획으로 분리 및 나노 LC-MS/MS를 사용하여 분석된다. 마스코트의 검색 엔진은 단백질 식별을위한 MS 데이터를 처리하는 데 사용되었다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
SCX 분리와 SCX 분리 한 다음 트립신 두 번째 소화 다음의 lysC와 (B) 첫 번째 소화 다음 트립신 (A), 제 1 및 제 2 소화를 수행 할 때 그림 2. 단백질 ID의 세포 구성 요소의 프로파일을 이동합니다. 모든 카테고리가 계산됩니다 비 제한적으로, 단백질은 세포 구성 요소에 대해 두 개 이상의 범주가있을 때.es.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3. GELFrEE, FASP 및 고해상도 MS를 사용 상향식 프로테오믹스 실험의 도식. 추출 된 단백질은 가용화하고 단백질 용 해물에서 염 및 원치 않는 오염물을 제거하기 위해 아세톤 (블루 튜브)를 사용하여 침전된다. 단백질 펠릿을 가용화하고 단백질 GELFrEE을 분획. 각 분획의 lysC 및 트립신 endoproteinases와 FASP를 사용하여 소화했다. 의 lysC 각 부분 마스코트를 사용하여 MS 데이터를 검색하여 확인 나노 LC-MS/MS 단백질을 사용하여 분석에서 (녹색 튜브) 및 트립 틱 펩타이드 (보라색 튜브). 큰를 보려면 여기를 클릭하십시오 R 이미지.
그림 4. 이전에 MS 분석에 대한 각 부분의 단백질 분리를 시각화하는 인공 감각 상피 GELFrEE 분수, 실버 묻은 젤. (M) 단백질 마커 (1) 분수 1, (3) 분수 2, (5) 분수 5, (7) 분획 07 (8) 분획 08 (9) 분획 09 (10) 분획 (10), (11) 분획 (11), (12) 분획 12. Darville 및 Sokolowski (24)의 허가 (적응) 재판. 미국 화학 학회에 의해 저작권 2013. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 5. GELFrEE 분리 및 GELFrEE 분리 후 트립신 두 번째 소화 다음의 lysC와 (B) 첫 번째 소화 한 후 트립신 제 1 및 제 2 소화 (A)를 수행 할 때 단백질 ID의 세포 구성 요소의 프로파일을 이동합니다. 모든 종류의 비 제한적으로 계산됩니다, 단백질은 세포 구성 요소에 대해 두 개 이상의 범주가있을 때. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. SCX, 왁스, 또는 GELFrEE 분리를 사용하여 식별 할 수있는 모든 단백질을 세포 구성 요소의 프로파일을 이동합니다. 단백질은 세포 구성 요소에 대해 두 개 이상의 종류, 그 준비되어 모두가 있었을 때의는 비 제한적으로 계산되었다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인공 감각 상피 세포에서 단백질 식별을 극대화하는 핵심 단계는 다음과 같습니다 소화 여러 endoproteinases의 1) 사용, 여러 분리 기술의 2) 사용 및 고해상도 질량 분석기의 3) 이용. 여러 효소의 적용은 펩티드의 수를 증가시키고, 단백질 서열 커버리지를 향상 따라서 인공 조직으로부터 확인 된 단백질의 수를 향상시킬 수있다. 트립신, 가장 일반적으로 사용되는 단백질 분해 효소는 MS의 이온화 및 분열에 좋은 펩타이드를 생성, 단백질을 효율적으로 특정 분열을 제공합니다. 그러나, 더 효율적 펩티드 절단을 제공 리신 잔기에서 절단하여도, lysC 내 등 종래 트립신 또 다른 효소를 사용. 그것은의 lysC / 트립신 소화로부터 생성 단백질의 서열 커버리지 트립신 / 트립신 다이제스트에서 단백질 서열 커버리지 단백질 서열 따르면 상대적 증가를 보여 주었다 관찰되었다.
"ove_content> 이전의 MS에 대한 다차원 분리의 구현은 샷건 프로테오믹스 접근 방식에 높은 인공 샘플의 복잡성을 감소시켰다.이 식별 할 수 일반적으로 어려운 막 단백질을 포함하여 더 많은 단백질의 식별을 허용했다. 막 단백질의 큰 수를 사용하여 확인되었다 상향식 접근 반대로 샷건 방법. 그러나, 더 낮은 풍부한 단백질의 식별을 허용 GELFrEE를 사용 상향식 접근법. 이는 달팽이관에서 개별로 cochlin 같은 높은 풍부한 단백질의 분리에 기인 분수.그러한 LTQ-Orbitrap 향상 및 달팽이관에서 식별 될 수 단백질의 수를 증가와 같은 고해상도 질량 분석기에 의해 본 프로토콜에서 달성 고품질 데이터. LTQ-Orbitrap는 높은 해상도, 높은 질량 정확성 및 펩티드의 분석을위한 높은 감도를 제공합니다. 이 악기 ENAB의 따라서, 응용 프로그램레 같은 인공 감각 상피 세포와 같은 복잡한 생물학적 시료에서 단백질의 식별 및 낮은 풍부한 펩타이드의 식별을 강화한다. MS의 강력한 도구를 사용하여 이러한 결합 된 실험적인 접근 방식의 활용이 크게 따라서 청각과 청각에 관련된 새로운 단백질 바이오 마커를 식별 할 수있는 기회를 개선, 인공 단백질 데이터 집합을 향상하는 데 도움이됩니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 박사 켄트 실리,이 기능의 사용에 대한 사우스 플로리다 대학의 약 발견과 혁신을위한 센터 (CDDI) 프로테오믹스 핵심 시설의 이사 감사합니다. 이 작품은 BHAS에 NIH / NIDCD 보조금 R01 DC004295에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm x 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
References
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