Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bottom-up og Shotgun Proteomics at identificere en omfattende Cochlear Proteome

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

Proteomanalyse af cochlear sensoriske epithel kan være en udfordring på grund af sin lille størrelse, og fordi membranproteiner er vanskeligt at isolere og identificere. Både membranen og opløselige proteiner, kan identificeres ved at kombinere flere præparative metoder og separationsteknikker sammen med høj opløsning massespektrometri.

Abstract

Proteomics er en almindeligt anvendt fremgangsmåde, der kan give indsigt i komplekse biologiske systemer. Cochlear sensoriske epithel indeholder receptorer, der transducerer den mekaniske energi af lyd i en elektro-kemisk energi behandles af de perifere og centrale nervesystem. Adskillige proteom teknikker er blevet udviklet til at studere cochlear indre øre, såsom todimensional forskel gelelektroforese (2D-DIGE) antistof mikroarray, og massespektrometri (MS). MS er den mest omfattende og alsidige værktøj i proteomics og i forbindelse med separation metoder kan give en dybdegående proteom af biologiske prøver. Separation metoder kombineret med MS har evnen til at berige protein prøver, påvisning med lav molekylvægt og hydrofobe proteiner og identificere lave talrige proteiner ved at reducere proteomet dynamikområde. Forskellige fordøjelse strategier kan anvendes til hel lysat eller fraktioneret proteinlysat at øge peptid og proteinsekvens dækning. Udnyttelse af forskellige separationsteknikker, herunder stærk kationbytter (SCX), omvendt fase (RP), og gel-elueret væskefraktion fastklemning elektroforese (GELFrEE) kan anvendes til at reducere prøve kompleksitet forud for MS-analyse for protein identifikation.

Introduction

Proteomics er studiet af komplekse biologiske systemer ved at analysere protein udtryk, funktion, modifikationer og interaktioner 1. Der er blevet anvendt flere metoder til proteomanalyse af det indre øre, herunder antistof microarray 2 todimensional gelelektroforese 3-5, og DIGE 6. Der er dog kun identificeret et begrænset antal proteiner og karakteriseret 2,7-10, i forhold til de over 10.000 gener og udtrykte sekvens tags (EST) identificeret i det indre øre 11,12, MS er den mest udbredte og omfattende teknik i proteomics til protein karakterisering. Analyse af komplekse proteom prøver, såsom cochlea, kan være udfordrende. Kombinationen af flere separationsteknikker MS muliggør identifikation af et større antal af peptider og proteiner på grund af en øget dynamisk koncentrationsområde og maksimal kapacitet 13. Multidimensional chromatograPHY reducerer meget komplekse proteinblandinger ved at tillade anvendelse af forskellige adsorption mekanismer. Der er to almindeligt anvendte MS proteomanalyse tilgange, shotgun og bottom-up proteomics. I shotgun proteomics, er en blanding af intakte proteiner fordøjes enzymatisk og separeret ved hjælp af multidimensionel kromatografi med stærk kationbytningskromatografi (SCX) efterfulgt af omvendt fase væskekromatografi (RPLC) 14,15. De separerede peptider er udsat for tandem MS og databasesøgning 15. En stor fordel ved denne teknik er, at tusindvis af proteiner kan identificeres i en enkelt analyse, og teknikken er bedre egnet til membranproteiner.

I bottom-up approach proteinet blanding adskilles, sædvanligvis ved en-eller todimensional elektroforese, og de individuelle proteinbånd eller pletter udskåret og fordøjet med et enzym, såsom trypsin, hvilket sædvanligvis resulterer i multiple peptider. Men en anden nyerely udviklet elektroforese tilgang, som anvendes i bottom-up proteomics, er GELFrEE. Denne teknik fraktionerer protein prøver i flydende fase og gør dem mindre kompleks inden analyse. Denne teknik er reproducerbare, tilbyder højt proteinindhold opsving, og reducerer distribution af høj rigelige proteiner i komplekse protein prøver 16. Peptider, som følge af separerede proteiner, analyseres ved MS, ved at bruge peptidmassefingeraftryk eller tandem MS (MS / MS), for at skabe sekvenstags for databasesøgning 17-19. Nogle af de store fordele ved at bruge bottom-up tilgang er evnen til at opnå høj opløsning separationer og omfattende protein dækning. Bottom-up proteomics er den mest udbredte teknik proteomics 20 dermed findes flere bioinformatik værktøjer. Desuden kan proteiner separeres i en kompleks blanding før fordøjelse, så der er en større chance for identifikation.

En af de store udfordringeri at bruge det indre øre for proteom analyse er dens lille størrelse, begrænset tilgængelighed og celletype mangfoldighed 21. Derudover har vigtige proteiner, der kendetegner dets funktionalitet, såsom ionkanaler, transportører og receptorer er membranproteiner, der kan være vanskelige at isolere 22. Således filter-aided prøveforberedelse (FASP) er en fordel for proteom analyser af væv, der er begrænset for protein udvinding og som kræver rengøringsmidler til at opløse membraner 23. Denne filtrering giver mulighed for MS-analyse af membran og opløselige proteiner og for evnen til at isolere peptider fra lavmolekylære forureninger 23,24.

Den nuværende protokol beskriver almindeligt anvendte proteom tilgange, som er kombineret og modificeret til at analysere både opløselige og membranproteiner og for at maksimere antallet af protein-id'er fra cochlea sensoriske epithel. Vi vil beskrive bruge shotgun proteomics med FASP multi-fordøjeion, ionbytningskromatografi, højopløsnings-MS og dataanalyse. Desuden vil vi beskrive bottom-up proteomics med GELFrEE, FASP multi-fordøjelse, høj opløsning MS, og dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etiske retningslinjer

Eksperimenter med mus væv blev godkendt af University of South Florida Institutional Animal Care og brug Udvalg (Protokoller 3931R, 3482R) som angivet i henhold til retningslinjerne for National Institutes of Health.

1.. Protein Extraction

  1. Isoler cochlear sensorisk epithel fra 16 30 dage gamle (P30) CBA / J-mus og opbevares ved -80 ° C.
  2. På dagen for forsøget vaskes vævet med 500 pi 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Centrifugeres i 3 minutter ved 1.000 x g, og supernatanten fjernes. Gentag for i alt tre vaske.
  3. Soniker væv til 30 sek på is i 100 pl lysepuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 pg / ml AEBSF, 10 ug / ml leupeptin, 100 ug / ml pepstatin, 2 ug / ml aprotinin og 0,5 ug / ml microcystin hjælp af en sonisk dismembrator (model 100; Thermo Fisher). Cool lysat på isi 1 minut mellem hver sonikering. Sonikeres alt 3x.
  4. Centrifugeres ekstrakten ved 750 xg ved 4 ° C i 2 minutter, og supernatanten fjernes til en ny mikrorør. Uddrag pellet i 50 pi lysisbuffer ved sonikering i 30 sekunder på is. Centrifugeres ekstrakten ved 750 xg ved 4 ° C i 2 minutter. Kombinere begge lysater og centrifugeres ved 28.600 xg ved 4 ° C i 60 min. Fjern supernatanten til en ny mikrorør og tilsættes 20 pi lysisbuffer indeholdende 0,1% ASB-14 til pelleten. Vortex i 1 min og inkuberes i 60 minutter ved 4 ° C.
  5. Prøven opvarmes ved 95 ° C i 5 minutter, hvorefter der afkøles ved 4 ° C i 60 min. Følg med centrifugering ved 16.000 x g ved 25 ° C i 10 min. Saml supernatanten og overføres til et nyt rør.
  6. Centrifugér suspensionen ved 16.000 xg ved 4 ° C i 5 minutter og fastholde supernatanten for fordøjelsen.

2. Dobbelt Tryptisk Protein Digestion af Whole Lysate Brug FASP

  1. Tilføj en 30 μl portion (≤ 400 mg) af cochlear proteinekstrakt, indeholdende 4% natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mM Tris-HCI, pH 7,6 og 0,1 M dithiothreitol (DTT) direkte til en 30K centrifugeringsfilter og blandes med 200 pi 8 M urinstof i Tris-HCI. Centrifuger ved 14.000 xg i 15 min.
  2. Fortynde koncentratet med 200 pi 8 M urinstofopløsning og centrifugeres ved 14.000 xg i 15 min.
  3. Der tilsættes 10 pi 10x iodacetamid (IAA) i 8 M urea-opløsningen til koncentratet i filteret og vortex i 1 min. Inkuber spin filter for 20 min ved stuetemperatur (RT) i mørke efterfulgt af centrifugering ved 14.000 xg i 10 min.
  4. Tilsæt 100 pi af 8 M urea-opløsningen til koncentratet på filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 15 min. Gentag dette trin 2x. Tilsæt 100 pi af 50 mM ammoniumbicarbonat (ABC) opløsning til filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 2x.
  5. Tilføj 0,4 pg / pl trypsin i 1:100 (w / w) enzym-til-Protein-forhold og inkuberes natten over (O / N) ved 37 ° C.
  6. Efter inkubering tilsættes 40 pi 50 mM ABC løsning filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 1x.
  7. Der tilsættes 50 ul af 0,5 M NaCl-opløsning til centrifugeringsfilteret og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Filtratet indeholdende de tryptiske peptider overføres til en frisk mikrorør og gøres sur med myresyre (FA) til 1,0% for at standse fordøjelsen.
  8. Vask filterenheden med 40 pi 8 M urinstof, og derefter vaske 2x med 40 ul 18 MOhm vand.
  9. Vask filterenheden 3x med 100 pi 50 mM ABC-opløsning. Efter den sidste vask tilsættes 0,4 pg / pl trypsin i 1:100 (w / w) enzym-til-protein-forhold og inkuberes O / N ved 37 ° C.
  10. Eluere tryptiske peptider fra den anden fordøje ved tilsætning af 40 ul 50 mM ABC løsning filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 1x.
  11. Der tilsættes 50 ul af 0,5 M NaCl-opløsning tilfilterenhed og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Filtratet indeholdende de tryptiske peptider Overførsel til en frisk mikrorør og forsure med FA til 1,0%.
  12. Prøverne kan kvantificeres under anvendelse af mikroplade kolorimetrisk assay under anvendelse af BSA som standard.

3. Endoproteinase LysC og Tryptisk proteinfordøjelsen af ​​Whole Lysate Brug FASP

  1. Tilføj en 30 pi alikvot (≤ 400 mg) af cochlear proteinekstrakt indeholdende 4% SDS, 100 mM Tris-HCI, pH 7,6 og 0,1 M DTT direkte til en 30K centrifugeringsfilter og blandes med 200 pi af 8 M urinstof i Tris-HCI . Centrifuger ved 14.000 xg i 15 min.
  2. Fortynde koncentratet med 200 pi 8 M urinstofopløsning og centrifugeres ved 14.000 xg i 15 min.
  3. Der tilsættes 10 pi 10x IAA i 8 M urinstofopløsning til koncentratet i filteret og vortex i 1 min. Inkuber spinnefilteret i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min.
  4. Tilsæt 100 ul 8 M urea solution til koncentratet på filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 15 min. Gentag dette trin 2x. Tilsæt 100 pi af 100 mM ABC løsning filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 2x.
  5. Tilføj 0,1 pg / pl endoproteinase LysC i en 01:50 (w / w) enzym-til-protein-forhold og inkuberes O / N ved 30 ° C.
  6. Efter inkubering tilsættes 40 pi 100 mM ABC løsning filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 1x.
  7. Der tilsættes 50 ul af 0,5 M NaCl-opløsning til centrifugeringsfilteret og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Filtratet indeholdende lysC peptider overføres til en frisk mikrorør og forsure med FA til 1,0% for at standse fordøjelsen.
  8. Vask filterenheden med 40 pi 8 M urinstof, og derefter vaske 2x med 40 ul 18 MOhm vand.
  9. Vask filterenheden 3x med 100 pi 50 mM ABC-opløsning. Efter den sidste vask tilsættes 0,4 pg / pl trypsin i 1:100 enzym-til-proproteinindsigt ratio og inkuber O / N ved 37 ° C.
  10. Eluer tryptiske peptider ved tilsætning af 40 pi af 50 mM ABC løsning filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 1x.
  11. Der tilsættes 50 ul af 0,5 M NaCl-opløsning til filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Filtratet indeholdende de tryptiske peptider Overførsel til en frisk mikrorør og forsure med 1,0% FA.
  12. Prøven kan kvantificeres under anvendelse af mikroplade kolorimetrisk assay med BSA som standard.

4.. Afsaltning Peptider Brug Spin Columns

  1. Aktiver en C 18 MacroSpin kolonne ved at tilsætte 500 pi acetonitril (ACN) og centrifugeres ved 1.100 xg i 1 min. Kassér gennemstrømning efter centrifugering.
  2. Ækvilibrer søjlen med 500 pi 0,1% FA og centrifugeres ved 1.100 x g i 1 min. Kassér gennemstrømning og gentag dette trin 1x.
  3. Tilføj op til 500 ul af peptidet fordøje til kolonnen end centrifuge ved 1.100 xg i 1 min. Hvis prøven volumen er større end 500 pi derefter gentage dette trin.
  4. Kolonnen udvaskes med 500 pi 0,1% FA og centrifugeres ved 1.100 xg i 1 min. Kassér gennemstrømning. Gentag dette trin 1x.
  5. Tilføj 250 pi af en 90:10 ACN-til-vand-forholdet til kolonnen og centrifuger ved 1.100 xg i 1 min. Saml eluenten indeholder afsaltet peptider og overføre til en frisk mikrorør. Gentag dette trin 1x.
  6. Tør afsaltede peptid prøve i et vakuum centrifuge og undgå at lade den tørre prøve helt.

5.. Ionbytningskromatografi

  1. Injicer 50-100 ug fordøjet protein prøve på en 200 x 2,1 mm, 5 um SCX-søjle (polysulfoethyl A) for at adskille peptider.
  2. Brug en gradient af 2-40% B i løbet af 50 minutter med en strømningshastighed på 250 ul / min. Opløsningsmiddel A er 5 mM ammoniumformiat, pH 3,0 i 25% acetonitril og 75% dobbeltdestilleret 2 O. Opløsningsmiddel B er 500 mM ammoniumformiat, pH6,0 i 25% ACN og 75% Hedeselskabet 2 O.
  3. Overvåg peptidfraktioner ved 280 nm og samle fraktionerne i 2 minutters intervaller under anvendelse af en fraktionsopsamler.
  4. Tørre fraktioner i et vakuum koncentrator og resuspender i 500 pi 50% acetonitril i ddH2O indeholdende 5% FA til at bistå med salt fjernelse.
  5. Redry fraktioner og opbevares ved -80 ° C, indtil klar til brug til nano LC-MS/MS analyse.

6.. Acetoneudfældning

Forud for GELFrEE separation cochlear protein supernatanten skal afsaltet. Acetoneudfældning kan anvendes til at afsalte og koncentrere proteiner.

  1. Tilføj tre volumener iskold acetone til cochlear supernatant. Forsigtigt vortexes og inkuberes ved -20 ° CO / N.
  2. Centrifuger prøveblandingen ved 15.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten fjernes.
  3. Vask proteinpellet 3x med afkølet acetone og centrifugeres ved 14.000 xg i 5 minutter ved 4° C.
  4. Air-tørre pellet og opløses i 112 ul 18 MOhm vand.
  5. Bestem koncentrationen protein under anvendelse af mikroplade kolorimetrisk assay.

7.. GELFrEE Fraktionering af Cochlear sensoriske epithel

  1. Tilsæt 30 pi 5x prøvebuffer (0,25 M Tris-HCI pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% glycerol, 0,5% (w / v) bromphenolblåt) til afsaltede protein suspenderet i 112 pi 18 MOhm vand.
  2. Tilføj 8 pi 1M DTT og varme ved 95 ° C i 5 minutter for at reducere protein-disulfidbindinger. Efter opvarmning tillader afkøling til stuetemperatur.
  3. Tilføj 8 ml løbebuffer anode reservoir 150 pi løbebuffer prøve opsamlingskammer, og 6 ml løbebuffer til katode reservoir.
  4. Fjerne enhver puffer, der kan have strømmet ind i sample-ladekammeret anvendelse af en pipette.
  5. Belastning 150 pi (≤ 1 mg) af cochlear proteinblandingen i prøven-loading kammer ved hjælp af en 8% Trer acetat patron med en masseområde på 3,5-150 kDa.
  6. Lavere elektroder og tæt instrument låg for at starte kørslen.
  7. På det første er sat på pause tid på instrumentet tilsættes 2 ml kører buffer til katoden reservoir og genoptage løb.
  8. Ved hver pause i interval på instrumentet, indsamle prøven fra prøveopsamlingskammer med en pipette og tilføje til en frisk mærket mikrorør. Vask Opsamlingskammeret 2x med 150 ul løbebuffer og kasseres.
  9. Tilføj 150 pi rindende buffer til prøveopsamlingskammer og genoptage løb. Saml proteinfraktioner over en periode på 2,6 timer i et totalvolumen på 150 ul / fraktion.

8.. 1D gelelektroforese af GELFrEE Brøker

1D gelelektroforese kan anvendes til at visualisere resultaterne fra GELFrEE fraktionering før enzymatisk fordøjelse og MS analyse. GELFrEE proteinfraktioner kan adskilles på en 4-15% Tris-HCI-gel.

  • Bland en 5 ul portion af hver GELFrEE fraktion med 5 ul prøve fortynding buffer (350 mM DTT i prøve buffer).
  • Opvarm prøverne ved 95 ° C i 3 minutter.
  • Cool prøver til RT.
  • Load 10 ul af hver GELFrEE fraktion i de enkelte gelbanerne og belastning 5 ul molekylvægt standard i den sidste ubrugte Lane.
  • Kør gel ved 125 V i 1,5 timer, eller indtil farvefronten når bunden af ​​gelen.
  • Gelen fjernes forsigtigt og plette med Silver Stain Plus at visualisere protein adskillelse.

    • 9.. Proteinfordøjelsen af ​​GELFrEE Brøker Brug FASP

    En modificeret FASP fremgangsmåde anvendes for vaskemiddel fjernelse og fordøjelse af GELFrEE fraktioner.

    1. Tilføj enkelte fraktion direkte til en 30K filterenhed, blandes med 200 ul af 8 M urinstof i Tris-HCI og centrifugeres ved 14.000 xg i 25 min.
    2. Fortynde koncentratet med 200 pi urinstofopløsningog centrifugeres ved 14.000 xg i 12 min. Gentag dette trin 1x.
    3. Der tilsættes 10 pi 10x IAA ureaopløsning til koncentratet i hver filterenhed, vortex i 1 min, og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    4. Tilsæt 100 ul af urinstof løsning koncentratet på filteranlæg og centrifugeres ved 14.000 xg i 15 min. Gentag dette trin 2x. Tilsæt 100 pi af 100 mM ABC løsning på filterenheder og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 2x.
    5. Tilføj 0,1 ug / ul LysC til 1:50 (w / w) enzym-til-protein-forhold på filterenheder og inkuberes O / N ved 30 ° C.
    6. Efter inkubering tilsættes 40 pi 100 mM ABC løsning spin filtre og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 1x.
    7. Der tilsættes 50 ul af 0,5 M NaCl-opløsning til spin filtre og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Filtratet indeholdende lysC peptider fra hver tur filter Overførsel til en frisk mikrorør og forsure med trifluoroacetic acid (TFA).
    8. Vask spin-filtre med 40 pi af 8 M urea, vask derefter 2x med 40 ul 18 MOhm vand.
    9. Vask spin filtre 3x med 100 pi 50 mM ABC-opløsning. Efter den sidste vask tilsættes 0,4 pg / pl trypsin i en 1:100 (w / w) enzym-til-protein-forhold og inkuberes O / N ved 37 ° C.
    10. Eluere tryptiske peptider fra hver filterenhed ved tilsætning af 40 ul 50 mM ABC-opløsning og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Gentag dette trin 1x.
    11. Der tilsættes 50 ul af 0,5 M NaCl-opløsning til filterenheder og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 min. Filtratet indeholdende de tryptiske peptider fra hver filterenhed Overførsel til en frisk mikrorør og forsure med TFA.
    12. Tør alle fordøjer i et vakuum koncentrator.

    10.. Prøveforberedelse til LC-MS/MS

    1. Opløs tørret LysC og tryptisk peptid fordøjer fraktioner i 20 ul 0,1% FA og vortex.
    2. Centrifugér prøver ved 20.000 xg i 10min og fjerne det øverste 95% af prøven til et nyt hætteglas.
    3. Indsprøjtes 5 ul af hvert peptid fraktion på et 100 um x 25 mm prøve-fælde for at fjerne salte og urenheder og udføre kromatografisk separation på en 75 mM × 10 cm C18-søjle.
    4. Brug en gradient af 2-40% B i 100 min med en strømningshastighed på 200 nl / min. Opløsningsmiddel A er 95% ddH2O og 5% acetonitril indeholdende 0,1% FA. Opløsningsmiddel B er 80% ACN og 20% ​​ddH2O indeholdende 0,1% FA.
    5. Saml ti tandem massespektre for hver MS scanning på en høj opløsning massespektrometer. En LTQ Orbitrap massespektrometer blev anvendt i dette eksperiment.

    11.. Protein Identification

    1. Identificer proteiner ved hjælp af UniProt musen database, der indeholder både fremad og tilbage protein-sekvenser og fælles forureninger. MaxQuant software med MASCOT søgemaskine bruges til at søge i protein-databasen.
    2. Søgeparametrene, der kan anvendes, indbefatter; fast modification af carbamidomethyl af cystein, variable ændringer af oxidation af methionin, protein-N-terminal acetylering, maksimalt 2 savnede kavalergang. Det mindste peptid længde at overveje for identifikation er 6 aminosyrer. Indtast et peptid massekoncentration på ± 8 ppm og et fragment masse tolerance på 1,2 Da (masse fejl er afhængig af massespektrometer bruges).
    3. I MaxQuant software, skal du bruge en 1% falsk opdagelse sats (FDR) for peptid og protein identifikation. Protein identifikation er opført med antallet af matchede peptider procent proteinsekvens dækning og peptidsekvenserne.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    For at opnå den mest omfattende proteom af cochlear sensoriske epithel er hurtig væv dissektion påkrævet forud for protein udvinding og prøveforberedelse. To proteom teknikker kan anvendes, shotgun og bottom-up proteomics. For at fremstille prøver til shotgun proteomics blev FASP fordøjelse, der anvendes som vist i figur 1. Den FASP metode giver mulighed for koncentration af proteiner, fjernelse af vaskemidler, og fordøjelsen af ​​proteiner ved hjælp af flere enzymer. Der var to dobbelt fordøjelse anvendte procedurer, hvor den første var en tryptisk fordøjelse efterfulgt af en anden fordøjelse med trypsin, som blev samlet, fraktioneret på en SCX-søjle i 18 fraktioner og analyseres ved nano LC-MS/MS. I alt 1.485 proteiner blev identificeret med en 1% FDR, når du udfører en enkelt-run LC-MS/MS bruge denne eksperimenterende tilgang. Blandt de identificerede proteiner, blev 329 og 258 proteiner kategoriseret i mitochondriet og plasmamembranen (figur2A). Den anden dobbelt fordøjelse procedure indeholdt LysC fordøjelse efterfulgt af trypsinfordøjelse. Hver fordøjelse blev individuelt indlæst og separeret på SCX-søjle i 18 fraktioner og analyseres ved nano LC-MS/MS. Resultaterne af LysC og trypsin-fordøjelser produceret i alt 3.503 proteiner med en 1% FDR. Figur 2B viser, at 605 og 617 proteiner blev kategoriseret i mitochondriet og plasmamembranen, hhv. Denne fremgangsmåde forudsat det største antal af membran-associeret protein-id'er. To analyser af LysC og trypsin fraktioner viste mere end 65% af de identificerede proteiner blev delt mellem forsøgene. Der var imidlertid også nyligt identificerede proteiner i gentagne analyse. De yderligere peptider og proteiner blev identificeret på grund af små ændringer i kromatografi derfor fører til forskellige peptider til opsplitning 25.

    Bottom-up proteomics blev anvendt ved hjælp GELFrEE fraktioneringfør LC-MS/MS som illustreret i figur 3.. Der var 12 GELFrEE fraktioner indsamlet. Forud for fordøjelsen og LC-MS/MS analyse, en sølv-farvet gel var parat til at visualisere resultaterne fra GELFrEE fraktionering som illustreret i fig. 4. Gelen viste protein separation ved stigende molekylvægt for hver fraktion fortløbende. Derfor blev de 12 GELFrEE væskefraktioner fordøjet ved hjælp af to forskellige multi-FASP fordøjelse tilgange og analyseret ved LC-MS/MS. Den første spaltning fremgangsmåde blev udført under anvendelse af en dobbelt trypsinfordøjelse, som førte til identifikation af 2.165 proteiner med en 1% FDR ved udførelse af en enkelt-run LC-MS/MS. Figur 5A viser, at der var 516 og 399 proteiner kategoriseret i mitochondriet og plasmamembranen, hhv. Den anden fordøjelse fremgangsmåde blev udført under anvendelse af endoproteinase LysC efterfulgt af trypsinfordøjelse. Single-run LC-MS/MS analyse identificerede 2.211 proteiner med en 1% FDR. Detfremgangsmåde viste et tilsvarende antal membran-associerede proteiner som ved brug af trypsin / trypsin fremgangsmåde (figur 5B). Massespektrometri proteomics data er blevet deponeret på ProteomeXchange Consortium 26 med datasættet identifier PXD000231 25. Kombination af resultaterne fra de forskellige teknikker resulterede i et stort antal membran og opløselige proteiner fra muse cochlea sensoriske epithel (figur 6).

    Figur 1
    Fig. 1. Skematisk af et haglgevær proteom eksperiment ved hjælp FASP, ionbytningskromatografi og høj opløsning MS. Proteiner ekstraheres, solubiliseret og spaltet under anvendelse FASP med LysC og trypsin endoproteinaser. LysC (grøn rør) og tryptiske peptider (lilla rør) er adskilt i mindre komplekse fraktioner bruger SCX kromatografi og analyseret ved hjælp af nano LC-MS/MS. MASCOT søgemaskine blev brugt til at behandle MS-data for protein identifikation. Klik her for at se større billede.

    Figur 2
    GO cellulære komponenter profil protein id'er Figur 2. Ved udførelse af en (A) første og anden fordøjelse med trypsin efterfulgt af SCX separation og (B) først fordøjelse med LysC efterfulgt af en anden fordøjelse med trypsin efterfulgt af SCX separation. Alle kategorier tælles ikke-begrænsende, når et protein har mere end en kategori for cellulære komponenter.es.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

    Figur 3
    Ekstraherede Figur 3.. Skematisk af en bottom-up proteomisk eksperiment ved hjælp GELFrEE, FASP og høj opløsning MS. Proteiner er opløst og proteiner udfældes med acetone (blå rør) for at fjerne salte og uønskede forureninger fra lysatet. Proteinet pellet solubiliseres og proteiner fraktioneret ved hjælp GELFrEE. Hver fraktion blev fordøjet ved hjælp af FASP med LysC og trypsin endoproteinaser. Den LysC (grønne rør) og tryptiske peptider (lilla rør) fra hver fraktion analyseres ved hjælp nano LC-MS/MS og proteiner identificeret ved at søge MS-data ved hjælp af MASCOT. Klik her for at se det i stort r billede.

    Figur 4
    Figur 4.. Sølvfarvet gel cochlear sensoriske epitel GELFrEE fraktioner at visualisere protein-separation i hver fraktion forud for MS-analyse. (M) Proteinmarkør (1) Fraktion 1 (3) Fraktion 2 (5) Fraktion 5 (7) Fraktion 7 (8) Fraktion 8 (9) Fraktion 9 (10), fraktion 10 (11) Fraktion 11 (12) Fraktion 12. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Darville og Sokolowski 24. Copyright 2013 ved American Chemical Society. Klik her for at se større billede.

    / Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
    Figur 5. GO cellulære komponenter profil protein id'er når der udføres en (A) første og anden fordøjelse med trypsin efter GELFrEE separation og (B) først fordøjelse med LysC efterfulgt af en anden fordøjelse med trypsin efter GELFrEE separation. Alle kategorier tælles ikke-begrænsende, når et protein har mere end en kategori for cellulære komponenter. Klik her for at se større billede.

    Figur 6
    Figur 6. GO cellulære komponenter profil for alle de identificerede proteiner ved hjælp SCX, voks eller GELFrEE separation. Når et protein havde mere end én kategori for cellulære komponenter, som alle dens categories blev talt ikke-begrænsende. Klik her for at se større billede.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De vigtigste skridt til at maksimere protein identifikation fra den cochlear sensoriske epithel er: 1) brug af flere endoproteinaser for fordøjelsen, 2) brug af flere separeringsteknikker, og 3) udnyttelse af en høj opløsning massespektrometer. Anvendelsen af ​​flere enzymer øger antallet af peptider og forbedrer proteinsekvens dækning dermed forbedre antallet af identificerede proteiner fra cochlear væv. Trypsin, de mest almindeligt anvendte protease giver en effektiv og specifik spaltning af proteiner, genererer peptider, som er god til MS ionisering og fragmentering. Men ved hjælp af et andet enzym forud for trypsin, såsom LysC, der også spalter på lysinrest, giver en mere effektiv peptid spaltning. Det blev observeret, at sekvensen dækning af proteiner genereres fra LysC / trypsinfordøjelse viste en stigning i proteinsekvens dækning i forhold til proteinsekvensen dækning fra trypsin / trypsin fordøjelse.

    ove_content "> Gennemførelse af flerdimensional adskillelse forud for MS reduceret høj cochlear prøve kompleksitet i shotgun proteom fremgangsmåde. Dette muliggjorde identifikation af flere proteiner, herunder membranproteiner, der typisk er vanskelige at identificere. Et større antal membranproteiner blev identificeret under anvendelse shotgun tilgang i modsætning til den bottom-up tilgang. Men bottom-up tilgang med GELFrEE tilladt for identifikation af mere lav rigelige proteiner. Dette skyldes, at isolation af højere rigelige proteiner, såsom cochlin fra cochlea, i individuelle fraktioner.

    De data af høj kvalitet, der er opnået i denne protokol ved en høj opløsning massespektrometer, såsom en LTQ-Orbitrap, forbedrer og øger antallet af proteiner, der kan identificeres i cochlea. Den LTQ-Orbitrap tilbyder høj opløsning, høj masse nøjagtighed og høj følsomhed til analyse af peptider. Derfor anvendes dette instrument Enables identifikation af proteiner fra komplekse biologiske prøver, såsom cochlear sensoriske epithel og forbedrer identifikation af lave rigelige peptider. Udnyttelse af disse kombinerede eksperimentelle metoder med den kraftfulde værktøj MS bidrager til at øge den cochlear protein datasæt, derigennem forbedre muligheden for at identificere nye protein biomarkører, der er involveret i at høre og døvhed.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

    Acknowledgments

    Forfatterne takker Dr. Kent Seeley, direktør for Center for Drug Discovery og Innovation (CDDI) Proteomics Core Facility ved University of South Florida for brug af denne facilitet. Dette arbejde blev støttet af NIH / NIDCD tilskud R01 DC004295 til BHAs

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
    2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
    3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
    4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
    5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
    6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
    7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
    8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
    9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
    10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
    11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
    12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
    13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
    14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
    15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
    16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
    17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
    18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
    19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
    20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
    21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
    22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
    23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
    24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
    25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
    26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

    Tags

    Biokemi Cochlear kromatografi LC-MS/MS massespektrometri Proteomics sensorisk epithel
    Bottom-up og Shotgun Proteomics at identificere en omfattende Cochlear Proteome
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter