Summary
ניתוח Proteome של האפיתל החושית השבלול יכול להיות מאתגר בשל גודלו הקטן ובגלל חלבוני קרום קשים לבודד ולזהות. הממברנה וחלבונים מסיסים שניהם יכולים להיות מזוהות על ידי שילוב של שיטות הכנה של מספר רב של טכניקות והפרדה יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה.
Abstract
פרוטאומיקה היא גישה נפוץ שיכול לספק תובנות לתוך מערכות ביולוגיות מורכבות. האפיתל החושית השבלול מכילה קולטנים שtransduce האנרגיה מכאנית של קול לאנרגית אלקטרו כימי מעובד על ידי מערכת עצבים ההיקפית ומרכזית. כמה טכניקות proteomic פותחו כדי ללמוד את שבלול האוזן פנימית, כגון אלקטרופורזה דו ממדי ג'ל ההבדל (2D-DIGE), microarray נוגדן, וספקטרומטריית מסה (MS). הטרשת הנפוצה היא הכלי המקיף והמגוונים ביותר בפרוטאומיקה בשיתוף עם שיטות הפרדה יכולה לספק proteome מעמיקה של דגימות ביולוגיות. יש שיטות הפרדה בשילוב עם MS היכולת להעשיר דגימות חלבון, לזהות במשקל מולקולרי נמוך וחלבונים הידרופובי, ולזהות חלבונים בשפע נמוכים על ידי צמצום הטווח הדינמי proteome. ניתן ליישם אסטרטגיות עיכול שונות לכל lysate או לlysate חלבון המופרד כדי לשפר את פפטיד וחלבוניםכיסוי רצף. ניצול של טכניקות שונות הפרדה, כוללים חילופי חזקים קטיון (SCX), התהפך השלב (RP), ואלקטרופורזה-eluted ג'ל הנוזלי מלכוד שבריר (GELFrEE) ניתן ליישם כדי להפחית את מורכבות מדגם לפני ניתוח MS לזיהוי חלבון.
Introduction
פרוטאומיקה היא המחקר של מערכות ביולוגיות מורכבות על ידי ניתוח ביטוי חלבון, תפקוד, שינויים, ואינטראקציות 1. כמה שיטות כבר נוצלו לניתוח proteome של האוזן הפנימית, כולל נוגדן microarray 2, ג'ל אלקטרופורזה דו ממדי 3-5, וDIGE 6. עם זאת, רק מספר מוגבל של חלבונים זוהה ואופיינו 2,7-10, בהשוואה לגנים מעל 10,000 ותגים הביעו רצף (ESTs) המזוהים באוזן הפנימית 11,12, הטרשת הנפוצה היא הטכניקה המקיפה ביותר והנפוץ לשימוש בפרוטאומיקה לאפיון חלבונים. ניתוח של דגימות proteomic מורכבות, כגון השבלול, יכול להיות מאתגר. עם זאת, שילוב של טכניקות הפרדה מרובות עם MS מאפשר זיהוי של מספר גדול יותר של פפטידים וחלבונים, בשל טווח ריכוז דינמי מוגבר וקיבולת שיא 13. chromatogra רב ממדיPHY מפחית תערובות חלבון מורכבות מאוד על ידי המאפשר שימוש במנגנוני ספיחה שונים. ישנן שתי גישות נפוצות MS ניתוח proteome, רובה ציד ופרוטאומיקה מלמטה למעלה. בפרוטאומיקה רובה הציד, תערובת של חלבונים שלמים מתעכלת enzymatically והמופרד באמצעות כרומטוגרפיה רב ממדית עם כרומטוגרפיה קטיון מטבע חזקה (SCX) ואחריו כרומטוגרפיה הפוכה-שלב נוזלי (RPLC) 14,15. פפטידים המופרדים חשופים לטנדם MS ומסד נתוני חיפוש 15. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא כי אלפי חלבונים יכולים להיות מזוהה בניתוח יחיד והטכניקה היא מתאימה יותר לחלבונים בממברנה.
בגישה מלמטה למעלה, תערובת החלבונים מופרדת, בדרך כלל על ידי אחד או אלקטרופורזה דו ממדים, ולהקות חלבון או כתמים הבודדים לגזור ומתעכלות עם אנזים כגון טריפסין, בדרך כלל כתוצאה מפפטידים מרובים. עם זאת, עוד יותר אחרוניםly פיתח גישת electrophoretic, המשמש בפרוטאומיקה מלמטה למעלה, הוא GELFrEE. טכניקה זו fractionates דגימות חלבון בנוזל שלב והופכת אותם פחות מורכב לפני הניתוח. טכניקה זו היא לשחזור, מציעה התאוששות חלבון גבוהה, ומפחיתה את החלוקה של חלבונים בשפע גבוהים בדגימות חלבון מורכבות 16. פפטידים, וכתוצאה מחלבונים הופרדו, נותחו על ידי MS, באמצעות טביעת אצבע פפטיד המונית או טנדם MS (MS / MS), כדי ליצור רצף תגים עבור מסד הנתונים חיפוש 17-19. חלק מן היתרונות העיקריים של שימוש בגישה מלמטה למעלה הוא היכולת להשיג הפרדות ברזולוציה גבוהה וכיסוי חלבון מקיף. פרוטאומיקה מלמטה למעלה היא הטכניקה הנפוצה ביותר בפרוטאומיקה 20, ולכן, כמה כלים לביואינפורמטיקה זמינים. בנוסף, ניתן להפריד חלבונים בתערובת מורכבת לפני העיכול, ולכן יש סיכוי גדול יותר של הזדהות.
אחד האתגרים הגדוליםבשימוש באוזן הפנימית לניתוח proteomic הוא הגודל שלה קטן, נגישות מוגבלת, וגיוון סוג התא 21. בנוסף, חלבונים מרכזיים המבדילה את הפונקציונליות שלו, כגון תעלות יונים, מובילים וקולטנים, הם חלבונים בממברנה, אשר יכול להיות קשה לבודד 22. לכן, הכנה בעזרת מסנן מדגם (FASP) היא יתרון עבור ניתוחי proteomic של רקמות כי הם מוגבלים להפקת חלבון ושדורשת חומרי ניקוי לsolubilize קרומים 23. סינון זה מאפשר ניתוח MS של הממברנה וחלבונים מסיסים וליכולת לבודד פפטידים ממזהמים במשקל מולקולריים נמוכים 23,24.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישות proteomic נפוצות שמשולבות והותאמו לניתוח חלבונים הן מסיסים וקרום וכדי למקסם את מספר תעודות הזהות של חלבון מהאפיתל החושית השבלול. נתאר באמצעות פרוטאומיקה רובה עם FASP רב לעכליון, כרומטוגרפיה החלפת יונים, ברזולוציה גבוהה בטרשת נפוצה, וניתוח נתונים. בנוסף, נתאר פרוטאומיקה מלמטה למעלה עם GELFrEE, FASP רב לעיכול, ברזולוציה גבוהה בטרשת נפוצה, וניתוח נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה
ניסויים באמצעות רקמות עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת הדרום פלורידה בבעלי חיים מוסדי טיפול השתמש הוועדה (הפרוטוקולים 3931R, 3482R) כפי שנקבעו על פי ההנחיות של המכון הלאומי לבריאות.
1. הפקת חלבון
- לבודד האפיתל חושית שבלול מ16 (P30) 30 ימים בת עכברי CBA / י חנות ב -80 ° C.
- ביום של הניסוי, לשטוף רקמות עם 500 μl של בופר פוספט 1x (PBS). צנטריפוגה במשך 3 דקות במהירות של 1,000 XG, ולהסיר את supernatant. חזור על פעולה עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
- רקמת Sonicate במשך 30 שניות על קרח של חיץ תמוגה 100 μl מכיל 50 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 120 mM NaCl, 50 מ"מ NAF, 5 מ"מ EDTA, 500 מיקרוגרם / מיליליטר AEBSF, 10 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר pepstatin, 2 מיקרוגרם / מיליליטר aprotinin, ו0.5 מיקרוגרם / מיליליטר microcystin באמצעות dismembrator קולי (דגם 100; תרמו פישר). lysate מגניב על קרח1 דקות בין כל sonication. Sonicate כולל של 3x.
- צנטריפוגה התמצית ב750 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולהסיר את supernatant לmicrotube חדש. לחלץ את הכדור ב50 μl של חיץ תמוגה ידי sonicating ל30 שניות על קרח. צנטריפוגה התמצית ב750 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לשלב את שני lysates ו צנטריפוגות ב 28,600 XG ב C ° 4 ל60 דקות. הסר את supernatant לmicrotube חדש ולהוסיף למאגר תמוגה 20 μl מכיל 0.1% ASB-14 לגלולה. מערבולת דקות 1 ו דגירה של 60 דקות ב 4 ° C.
- מחממים את המדגם על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן מגניב ב-C ° 4 ל60 דקות. פעל עם צנטריפוגה XG 16,000 ב25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאסוף את supernatant ולהעביר לצינור חדש.
- צנטריפוגה ההשעיה XG 16,000 על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולשמור את supernatant לעיכול.
2. עיכול זוגי tryptic חלבון של השלמה Lysate שימוש FASP
- הוספת 30 μaliquot ליטר (≤ 400 מיקרוגרם) של תמצית חלבון שבלול, המכילה 4% נתרן גופרתי dodecyl (SDS), 100 מ"מ טריס-HCl, pH 7.6 ו0.1 M dithiothreitol (DTT) ישירות למסנן ספין 30K ולערבב עם 200 μl של 8 האוריאה M בטריס-HCl. צנטריפוגה ב XG 14,000 במשך 15 דקות.
- לדלל את התרכיז עם 200 μl של פתרון האוריאה ז 8 ו צנטריפוגות ב XG 14,000 במשך 15 דקות.
- הוסף 10 μl של 10x iodoacetamide (רש"ת) ב8 פתרון M אוריאה ללהתרכז במסנן ומערבולת דקות 1. דגירה מסנן הספין ל20 דקות בטמפרטורת חדר (RT) בחושך ואחריו צנטריפוגה ב14,000 XG במשך 10 דקות.
- הוספה של פתרון האוריאה ז 8 100 μl ללהתרכז ביחידת המסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 במשך 15 דקות. חזור 2x שלב זה. הוספה של אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ פתרון (ABC) ליחידת המסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות 100 μl. חזור 2x שלב זה.
- הוספת 0.4 מיקרוגרם / μl של טריפסין ב1:100 (w / w) אנזים לחלבון יחס ודגירת הלילה (O / N) ב 37 ° C.
- לאחר דגירה, להוסיף 40 μl של 50 פתרון מ"מ ABC לסנן יחידה ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. חזור על 1x שלב זה.
- הוסף 50 μl של 0.5 פתרון M NaCl למסנן הספין ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. העבר את התסנין המכיל פפטידים tryptic לmicrotube טרי ולהפוך לחומצה עם חומצה פורמית (FA) ל1.0% כדי לעצור את מערכת העיכול.
- שטוף את יחידת המסנן עם 40 μl של 8 M אוריאה, ולאחר מכן לשטוף עם 2x 40 μl 18 MΩ מים.
- לשטוף 3x יחידת המסנן עם 50 פתרון מ"מ ABC 100 μl. לאחר לשטוף הסופי להוסיף 0.4 מיקרוגרם / μl של טריפסין ב1:100 יחס אנזים לחלבון (w / w) ודגירת O / N ב 37 ° C.
- Elute פפטידים tryptic מהשני לעכל ידי הוספת 40 μl של פתרון 50 מ"מ ABC ליחידת המסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. חזור על 1x שלב זה.
- הוסף 50 μl של 0.5 פתרון M NaCl כדייחידת מסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. העבר את התסנין המכיל פפטידים tryptic לmicrotube טרי ולהפוך לחומצה עם FA ל1.0%.
- ניתן לכמת הדגימות באמצעות assay colorimetric microplate באמצעות BSA כסטנדרט.
3. עיכול חלבון Endoproteinase LysC וtryptic של השלמה Lysate שימוש FASP
- הוספת aliquot 30 μl (≤ 400 מיקרוגרם) של תמצית חלבון שבלול המכילה 4% SDS, 100 מ"מ טריס-HCl, pH 7.6 ו0.1 M DTT ישירות למסנן ספין 30K ולערבב עם 200 μl של 8 מ אוריאה בטריס-HCl . צנטריפוגה ב XG 14,000 במשך 15 דקות.
- לדלל את התרכיז עם 200 μl של פתרון האוריאה ז 8 ו צנטריפוגות ב XG 14,000 במשך 15 דקות.
- הוסף 10 μl של 10x רשות העתיקות ב8 פתרון M אוריאה ללהתרכז במסנן ומערבולת דקות 1. דגירה מסנן הספין ל20 דקות ב RT בחושך אז צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות.
- הוספה של סול האוריאה ז 8 100 μlution ללהתרכז ביחידת המסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 במשך 15 דקות. חזור 2x שלב זה. הוספה של 100 פתרון מ"מ ABC ליחידת המסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות 100 μl. חזור 2x שלב זה.
- הוסף 0.1 מיקרוגרם / μl של endoproteinase LysC ביחס אנזים לחלבון 01:50 (w / w) ודגירת O / N ב 30 ° C.
- לאחר דגירה, להוסיף 40 μl של 100 פתרון מ"מ ABC ליחידת המסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. חזור על 1x שלב זה.
- הוסף 50 μl של 0.5 פתרון M NaCl למסנן הספין ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. העבר את התסנין המכיל פפטידים LysC לmicrotube טרי ולהפוך לחומצה עם FA ל1.0% כדי לעצור את מערכת העיכול.
- שטוף את יחידת המסנן עם 40 μl של 8 M אוריאה, ולאחר מכן לשטוף עם 2x 40 μl 18 MΩ מים.
- לשטוף 3x יחידת המסנן עם 50 פתרון מ"מ ABC 100 μl. לאחר לשטוף הסופי להוסיף 0.4 מיקרוגרם / μl של טריפסין ב1:100 אנזים לפרויחס טיין ודגירת O / N ב 37 ° C.
- Elute פפטידים tryptic ידי הוספת 40 μl של פתרון 50 מ"מ ABC ליחידת המסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. חזור על 1x שלב זה.
- הוסף 50 μl של 0.5 פתרון M NaCl ליחידת המסנן ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. העבר את התסנין המכיל פפטידים tryptic לmicrotube טרי ולהפוך לחומצה עם 1.0% FA.
- המדגם ניתן לכמת באמצעות assay colorimetric microplate עם BSA כסטנדרט.
4. פפטידים desalting באמצעות עמודות ספין
- הפעל עמודת MacroSpin 18 C על ידי הוספת 500 μl של אצטוניטריל (ACN) ו צנטריפוגות ב 1,100 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך לאחר צנטריפוגה.
- לאזן את העמודה עם 500 μl של .0.1% FA ו צנטריפוגות ב 1,100 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך ולחזור 1x שלב זה.
- הוסף עד 500 μl של הפפטיד לעכל לעמודהצנטריפוגה ד ב1,100 XG דקות 1. אם נפח הדגימה גדול יותר מ500 μl לאחר מכן חזור על שלב זה.
- לשטוף את העמודה עם 500 μl של .0.1% FA ו צנטריפוגות ב 1,100 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרכו. חזור על 1x שלב זה.
- הוסף 250 μl של יחס 90:10 ACN למים לעמודה ו צנטריפוגות ב 1,100 XG דקות 1. לאסוף eluent המכיל פפטידים desalted ולהעביר לmicrotube טרי. חזור על 1x שלב זה.
- ייבש את מדגם פפטיד desalted בצנטריפוגה ואקום ולהימנע לתת יבש המדגם לחלוטין.
5. Ion Exchange כרומטוגרפיה
- הזרק 50-100 מיקרוגרם של מדגם חלבון מתעכל על מ"מ 200 x 2.1, 5 טור SCX מיקרומטר (Polysulfoethyl) להפריד פפטידים.
- השתמש בשיפוע של 2-40% B מעל 50 דקות עם קצב זרימה של 250 μl / min. ממס הוא formate 5 מ"מ אמוניום, pH 3.0 באצטוניטריל 25% ו75% DDH 2 O. B ממס הוא formate אמוניום 500 מ"מ, pHACN 6.0 ב25% ו75% DDH 2 O.
- לפקח על שברי פפטיד ב280 ננומטר ולאסוף את השברים ב2 דקות במרווחים באמצעות אספן שבריר.
- שברים יבשים ברכז ואקום ו resuspend ב 500 μl של אצטוניטריל 50% בDDH 2 O המכיל 5% FA על מנת לסייע בהסרת מלח.
- שברים Redry ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לשימוש לניתוח LC-MS/MS ננו.
6. רטיבות אצטון
לפני הפרדת GELFrEE supernatant חלבון השבלול יש desalted. ממטרים אצטון יכולים לשמש כדי desalt ולהתרכז חלבונים.
- הוסף שלושה כרכים של אצטון קר כקרח לsupernatant השבלול. בעדינות המערבולת ולדגור על -20 ° CO / נ
- צנטריפוגה תערובת המדגם ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
- לשטוף 3x גלולה החלבון עם אצטון ו צנטריפוגות המצוננים ב14,000 XG במשך 5 דקות ב 4° C.
- אוויר יבש גלולה ולהתמוסס ב112 μl 18 MΩ מים.
- לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות assay colorimetric microplate.
7. GELFrEE היפוך חלוק של השבלול החושי האפיתל
- הוסף 30 μl של חיץ מדגם 5x (0.25 M טריס-HCl pH 6.8, 10% (w / v) SDS, גליצרול 50%, 0.5% (w bromophenol / V) כחול) לחלבון desalted המושעה ב112 μl 18 MΩ מים.
- הוסף 8 μl של 1M DTT וחום על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להפחית את חוב דיסולפיד חלבון. לאחר החימום מאפשר קירור לטמפרטורת חדר.
- הוסף 8 מיליליטר של הפעלת מאגר למאגר האנודה, 150 μl של הפעלת המאגר לדגום תא איסוף, ו6 מיליליטר של הפעלת מאגר למאגר קתודה.
- הסר את כל חיץ שייתכן שזרם לחדר מדגם הטעינה באמצעות פיפטה.
- טען 150 μl (≤ 1 מ"ג) של תערובת חלבוני השבלול, לתוך תא מדגם הטעינה באמצעות 8% Trהוא יצטט מחסנית עם מגוון המוני של 3.5-150 kDa.
- אלקטרודות תחתונה ומכסה מכשיר קרוב להתחיל לרוץ.
- בזמן שהושהה הראשון על המכשיר מוסיף 2 מיליליטר של הפעלת מאגר למאגר הקתודה ולחדש את הריצה.
- בכל מרווח עצר על המכשיר, לאסוף הדגימה מהאולם איסוף דגימה באמצעות פיפטה ולהוסיף לmicrotube כותרתו טרי. לשטוף 2x חדר אוסף עם 150 μl של הפעלת מאגר וזורק.
- הוסף 150 μl של חיץ ריצה טרי לתא איסוף דגימה ולחדש את הריצה. לאסוף את השברים חלבון על פני תקופת זמן של 2.6 שעה בנפח כולל של 150 μl / שבריר.
8. 1D ג'ל אלקטרופורזה של שברי GELFrEE
ג'ל אלקטרופורזה 1D יכולה לשמש כדי לחזות את התוצאות מחלוקת GELFrEE לפני עיכול אנזימטי וניתוח טרשת נפוצה. ניתן להפריד שברים חלבון GELFrEE על 4-15% ג'ל טריס-HCl.
9. עיכול חלבון של שברי GELFrEE שימוש FASP
הליך FASP שונה משמש להסרת חומר ניקוי ועיכול של השברים GELFrEE.
- הוסף כל שבריר בודד ישירות אל יחידת מסנן 30K; לערבב עם 200 μl של 8 מ אוריאה בטריס-HCl ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 25 דקות.
- לדלל את התרכיז עם 200 μl של פתרון אוריאהו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 12 דקות. חזור על 1x שלב זה.
- הוסף 10 μl של 10x רשות העתיקות בפתרון אוריאה ללהתרכז בכל יחידת סינון, מערבולת דקות 1, ו דגירה במשך 30 דקות ב RT בחושך.
- הוספה של פתרון אוריאה 100 μl ללהתרכז ביחידות הסינון וצנטריפוגות ב XG 14,000 במשך 15 דקות. חזור 2x שלב זה. הוספה של 100 פתרון מ"מ ABC ליחידות הסינון וצנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות 100 μl. חזור 2x שלב זה.
- הוסף 0.1 מיקרוגרם / μl של LysC ליחס אנזים לחלבון 1:50 (w / w) ליחידות הסינון ודגירת O / N ב 30 ° C.
- לאחר דגירה, להוסיף 40 μl של 100 פתרון מ"מ ABC למסנני הספין ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. חזור על 1x שלב זה.
- הוסף 50 μl של 0.5 פתרון M NaCl למסנני הספין ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. העבר את התסנין המכיל פפטידים LysC מכל מסנן ספין לmicrotube טרי ולהפוך לחומצה עם trifluoroacחומצת etic (TFA).
- שטוף את מסנני ספין עם 40 μl של 8 M אוריאה, ולאחר מכן לשטוף עם 2x 40 μl 18 MΩ מים.
- שטוף את מסנני ספין 3x עם 50 פתרון מ"מ ABC 100 μl. לאחר לשטוף הסופי להוסיף 0.4 מיקרוגרם / μl של טריפסין ביחס אנזים לחלבון 1:100 (w / w) ודגירת O / N ב 37 ° C.
- Elute פפטידים tryptic מכל יחידת סינון על ידי הוספת 40 μl של 50 פתרון מ"מ ABC ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. חזור על 1x שלב זה.
- הוסף 50 μl של 0.5 פתרון M NaCl ליחידות הסינון וצנטריפוגות ב XG 14,000 עבור 10 דקות. העבר את התסנין המכיל פפטידים tryptic מכל יחידת סינון לmicrotube טרי ולהפוך לחומצה עם TFA.
- ייבש את כל מעכל ברכז ואקום.
10. לדוגמא הכנה לLC-MS/MS
- LysC מחדש מיובש ופפטיד tryptic מעכלים שברים ב20 μl של .0.1% FA ומערבולת.
- צנטריפוגה דגימות 20,000 XG במשך 10דקות ולהסיר 95% העליונים של מדגם לבקבוקון מדגם חדש.
- הזרק 5 μl של כל חלק פפטיד על מלכודת מדגם x 25 מ"מ 100 מיקרומטר כדי להסיר מלחים ומזהמים ולבצע הפרדת chromatographic על עמודת 18 75 מיקרומטר × 10 C סנטימטר.
- השתמש בשיפוע של 2-40% B מעל 100 דקות עם קצב זרימה של 200 / דקות NL. ממס הוא ddH2O 95% ואצטוניטריל 5% מכיל 0.1% FA. B ממס הוא ACN 80% וddH2O 20% מכיל 0.1% FA.
- לאסוף עשרה ספקטרום המוני מקביל עבור כל MS לסרוק בספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. ספקטרומטר מסת LTQ Orbitrap היה בשימוש בניסוי זה.
11. זיהוי חלבון
- זיהוי חלבונים באמצעות מסד נתונים המכילים גם עכבר UniProt קדימה לאחור רצפי חלבונים ומזהמים נפוצים. תוכנת MaxQuant עם מנוע חיפוש קמע משמשת לחיפוש בבסיס נתוני החלבון.
- הפרמטרים החיפוש שיכול לשמש כוללים; modific קבועע carbamidomethyl של ציסטאין, שינויים משתנים מחמצון של מתיונין, acetylation N-מסוף החלבון, לכל היותר 2 החמיצו מחשוף. אורך הפפטיד המינימום לשקול לזיהוי הוא 6 חומצות אמינו. הזן את שגיאת ריכוז מסת פפטיד של ± 8 עמודים לדקה ובסובלנות המונית בר 1.2 דא (שגיאה המונית תלויה בשימוש ספקטרומטר המסה).
- בתוכנת MaxQuant, השתמש 1% שיעור גילוי שווא (רוזוולט) לזיהוי פפטיד וחלבונים. זיהוי חלבון מופיע עם מספר פפטידים מתאימים, כיסוי רצף חלבון אחוזים, ורצפי פפטיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להשיג את proteome המקיפה ביותר של האפיתל החושית השבלול, נתיחת רקמות מהירה נדרשת לפני מיצוי חלבון והכנת מדגם. ניתן להשתמש בשתי שיטות proteomic, פרוטאומיקה רובה ומלמטה למעלה. כדי להכין את הדגימות לפרוטאומיקה רובה הציד, הליך עיכול FASP שימש כפי שמודגם באיור 1. שיטת FASP מאפשרת ריכוז של חלבונים, הסרת חומרי ניקוי, ועיכול של חלבונים באמצעות אנזימים רבים. היו שני הליכים כפולים עיכול משמשים, הראשון היה עיכול tryptic ואחרי עיכול שני עם טריפסין, שהיו נקווה, מופרד על עמודת SCX ל18 שברים ונותח על ידי LC-MS/MS ננו. סך של 1,485 חלבונים זוהו עם רוזוולט 1% בעת ביצוע LC-MS/MS להפעיל יחיד באמצעות הגישה הניסויית הזה. בין החלבונים שזוהו, 329 ו258 חלבונים סווגו בקרום המיטוכונדריה ופלזמה, בהתאמה (איור2 א). הליך העיכול הכפול השני כלל עיכול LysC ואחרי עיכול טריפסין. כל לעכל נטען בנפרד והפריד בעמודת SCX ל18 שברים ונותחו על ידי LC-MS/MS ננו. תוצאות LysC וdigestions טריפסין מיוצרות כוללת של 3,503 חלבונים עם 1% רוזוולט. איור 2 מראה כי 605 ו617 חלבונים סווגו בmitochondrion וקרום פלזמה, בהתאמה. גישה זו סיפקה את המספר הגדול ביותר של תעודות הקשורים חלבון הממברנה. ניתוח כפול של LysC והשברים טריפסין הראה יותר מ 65% מהחלבונים שזוהו משותפים בין הניסויים. עם זאת, היו גם חלבונים שזוהו לאחרונה בניתוח לשכפל. פפטידים וחלבונים נוספים זוהו כתוצאה משינויים קטנים בכרומטוגרפיה, ולכן מובילים לפפטידים שונים לפיצול 25.
פרוטאומיקה מלמטה למעלה יושמה באמצעות חלוקה GELFrEEלפני LC-MS/MS כפי שמודגם באיור 3. היו 12 שברים GELFrEE שנאספו. לפני עיכול וניתוח LC-MS/MS, ג'ל מוכתם כסף היה מוכן לדמיין את התוצאות מחלוקת GELFrEE כפי שמודגם באיור 4. ג'ל הראה הפרדת חלבונים על ידי הגדלת משקל מולקולרי עבור כל חלקיק ברציפות. לכן, השברים נוזל GELFrEE 12 היו מתעכלים באמצעות שתי גישות עיכול רב FASP שונות ונותחו על ידי LC-MS/MS. גישת העיכול הראשונה בוצעה באמצעות עיכול טריפסין כפול, שהוביל לזיהוי של 2,165 חלבונים עם 1% רוזוולט בעת ביצוע LC-MS/MS אחת ארוך. איור 5A מראה שהיו 516 ו399 חלבונים מסווגים בmitochondrion וקרום פלזמה, בהתאמה. גישת העיכול השנייה בוצעה באמצעות endoproteinase LysC ואחרי עיכול טריפסין. ניתוח LC-MS/MS יחידה ריצה זיהה 2,211 חלבונים עם רוזוולט 1%. זהגישה הראתה מספר דומה של חלבוני קרום הקשורים כמו בעת שימוש בגישת טריפסין / טריפסין (איור 5). פרוטאומיקה ספקטרומטריית מסת נתונים הופקדו לProteomeXchange Consortium 26 עם מזהה ערכת נתונים PXD000231 25. שילוב של התוצאות מהטכניקות השונות הביאו מספר גדול של הממברנה וחלבונים מסיסים מהאפיתל החושית שבלול עכבר (איור 6).
איור 1. סכמטי של ניסוי proteomic רובה באמצעות FASP, כרומטוגרפיה חילוף יונים, ורזולוציה גבוהה טרשת נפוצה. חלבונים חילוץ, solubilized, ומתעכלים באמצעות FASP עם LysC וendoproteinases טריפסין. LysC (צינור ירוק) ופפטידים tryptic (סגול צינור) מופרדים לשברים פחות מורכבים באמצעות כרומטוגרפיה SCX ונותח באמצעות LC-MS/MS ננו. מנוע חיפוש הקמע שימש לעיבוד נתוני MS לזיהוי חלבון. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. GO פרופיל מרכיבים התאיים של תעודות זהות של חלבון בעת ביצוע () עיכול ראשון והשני עם טריפסין ואחרי הפרדת SCX ו( ב ') עיכול ראשון עם LysC ואחרי עיכול שני עם טריפסין ואחרי הפרדת SCX. כל הקטגוריות נספרות nonexclusively, כאשר חלבון יש יותר מקטגוריה אחת למרכיבים תאיים."Target =" es.jpg _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
חלבוני איור 3. סכמטי של ניסוי proteomic מלמטה למעלה באמצעות GELFrEE, FASP, ורזולוציה גבוהה טרשת נפוצה. חולצו solubilized וחלבונים הם זירז באמצעות אצטון (צינור כחול) כדי להסיר מלחים ומזהמים לא רצויים מlysate. גלולה החלבון היא solubilized וחלבונים מופרדים באמצעות GELFrEE. כל חלק היה מתעכל באמצעות FASP עם LysC וendoproteinases טריפסין. LysC (צינורות ירוקים) ופפטידים tryptic (צינורות סגולים) כל חלק מהם נותחו באמצעות LC-MS/MS ננו וחלבונים שזוהה על ידי חיפוש נתונים MS באמצעות קמע. לחץ כאן כדי להציג גדול תמונת r.
איור 4. ג'ל מוכתם כסף של שברים שבלול חושיים GELFrEE האפיתל, כדי להמחיש הפרדת חלבונים בכל שבריר לפני ניתוח MS. (M) סמן חלבון, (1) חלק 1, (3) חלק 2, (5) חלק 5, (7) חלק 7, (8) שבר 8, (9) חלק 9, חלק (10) 10, שבר (11) 11, שבר (12) 12. הודפס מחדש (מותאם) באישור Darville ו24 סוקולובסקי. כל הזכויות שמורות 2013 על ידי האגודה האמריקנית לכימיה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
/ Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
איור 5. GO פרופיל מרכיבים התאיים של תעודות זהות של חלבון בעת ביצוע () ראשון ושני עיכול עם טריפסין לאחר הפרדת GELFrEE ו( ב ') עיכול ראשון עם LysC ואחרי עיכול שני עם טריפסין לאחר הפרדת GELFrEE. כל הקטגוריות נספרות nonexclusively, כאשר חלבון יש יותר מקטגוריה אחת לרכיבים סלולריים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 6. GO פרופיל רכיבים סלולריים לכל החלבונים שזוהו באמצעות SCX, שעווה, או הפרדת GELFrEE. כאשר חלבון היה יותר מקטגוריה אחת לרכיבים סלולריים, כל קטוגרייתים נספר nonexclusively. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדי המפתח למקסם זיהוי חלבון מהאפיתל חושית השבלול הם: 1) שימוש בendoproteinases מרובה לעיכול, 2) שימוש בטכניקות הפרדה מרובות, ו3) ניצול של ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. היישום של אנזימים מרובים מגדיל את מספר פפטידים ומשפר את כיסוי רצף חלבון, ומכאן שיפור במספר חלבונים המזוהים מרקמת השבלול. טריפסין, פרוטאז הנפוץ ביותר מספק מחשוף יעיל וספציפי של חלבונים, יצירת פפטידים כי הם טובים ליינון MS ופיצול. עם זאת, באמצעות אנזים אחר לפני טריפסין, כגון LysC, שגם דבק בשאריות ליזין, מספק מחשוף הפפטיד יעיל יותר. זה היה ציין כי כיסוי הרצף של החלבונים המופקים מעיכול LysC / טריפסין הראה עלייה בביחס כיסוי רצף חלבון לכיסוי רצף החלבון מטריפסין / טריפסין לעכל.
ove_content "> יישום הפרדה רב ממדית לפני MS הפחית את מורכבות מדגם שבלול גבוהות בגישת proteomic רובה הציד. זה אפשר לזיהוי של יותר חלבונים, כולל חלבונים בממברנה, אשר קשים בדרך כלל לזהות. מספר גדול יותר של חלבונים בממברנה זוהו באמצעות גישת רובה הציד בניגוד לגישה מלמטה למעלה. עם זאת, הגישה מלמטה למעלה באמצעות GELFrEE אפשר זיהוי של חלבונים בשפע נמוכים יותר. זאת בשל הבידוד של חלבונים בשפע גבוה יותר, כגון cochlin מהשבלול, לאדם שברים.נתונים באיכות גבוהה שהושגו בפרוטוקול הנוכחי על ידי ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, כגון LTQ-Orbitrap, משפר ומגדיל את מספר החלבונים שיכולים להיות מזוהה בשבלול האוזן. LTQ-Orbitrap מציע רזולוציה גבוהה, דיוק מסה גבוה, ורגישות גבוהה לניתוח של פפטידים. לפיכך, יישום של enab מכשיר זהזיהוי les של חלבונים מדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון האפיתל החושית השבלול ומשפר את זיהוי של פפטידים שפע נמוכים. ניצול של גישות אלה בשילוב ניסיוני עם כלי רב עוצמה של טרשת נפוצה מסייע להגדיל באופן משמעותי את בסיס נתוני חלבון השבלול, ולכן שיפור ההזדמנות לזהות סמנים ביולוגיים חלבון חדשים מעורבים בשמיעה וחירשת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר קנט סילי, מנהל המרכז לגילוי תרופות וחדשנות (CDDI) מתקן פרוטאומיקה ליבה באוניברסיטה של דרום פלורידה לשימוש במתקן זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NIDCD R01 DC004295 לBHAS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm x 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
References
- Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
- Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
- Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
- Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
- Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
- Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
- Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
- Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
- Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
- Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
- Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
- Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
- Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
- Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
- Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
- Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
- Aebersold, R., Mann, M.
- Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
- Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R.
- Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
- Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
- Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).
