Summary

La cornée micropoche test: Un modèle de l'angiogenèse dans l'oeil de la souris

Published: August 16, 2014
doi:

Summary

Le protocole décrit l'essai de micropoche de la cornée tel que développé chez la souris.

Abstract

L'essai de micropoche de la cornée de la souris est un test robuste et quantitative in vivo pour l'évaluation de l'angiogenèse. En utilisant des pastilles standardisés à libération lente contenant des facteurs de croissance spécifiques qui déclenchent la croissance des vaisseaux sanguins tout au long de la cornée naturelle avasculaire, l'angiogenèse peut être mesurée et quantifiée. Dans cet essai, la réponse angiogénique est généré au cours de plusieurs jours, selon le type et la dose de facteurs de croissance utilisé. L'induction de la néovascularisation est généralement déclenchée soit par le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) ou un facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). La combinaison de ces facteurs de croissance avec le sucralfate et hydron (poly-HEMA (poly (méthacrylate de 2-hydroxyéthyle))) et couler le mélange en pastilles, ils peuvent être implantés chirurgicalement dans l'oeil de la souris. Ces pastilles uniformes libèrent lentement les facteurs de croissance au cours de cinq ou six jours (bFGF ou VEGF respectivement) permettant réponse angiogénique suffisant requis pour la zone de la cuve qUANTIFICATION en utilisant une lampe à fente. Ce dosage peut être utilisé pour différentes applications, y compris l'évaluation de médicaments modulateurs angiogéniques ou des traitements, ainsi que la comparaison entre les différents fonds génétiques qui affectent l'angiogénèse. Un enquêteur qualifié après avoir pratiqué ce test peut implanter une pastille en moins de 5 minutes par œil.

Introduction

Le processus de l'angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins se forment des préexistants, est très complexe et est régulée par plusieurs facteurs endogènes qui contrôlent les différentes étapes de la germination et de la morphogenèse de la cuve. L'angiogenèse est déclenchée en raison d'un changement dans l'équilibre entre les facteurs pro et anti-angiogéniques, un équilibre qui maintient normalement le système vasculaire dans un état de repos. L'angiogenèse se produit chez l'adulte dans certaines conditions physiologiques, tels que au cours du cycle ovarien femelle ou dans les processus de réparation tels que la cicatrisation des plaies et la régénération des tissus. Cependant, il est également une caractéristique de nombreuses pathologies, notamment les tumeurs malignes, les conditions auto-immunes et des maladies inflammatoires. L'implication de l'angiogenèse dans les conditions physiologiques et pathologiques, il est un important sujet de recherche et une cible intéressante pour une thérapie.

En raison de la complexité de l'angiogenèse et de l'implication de plusieurs CElls et les facteurs dans le processus, y compris les cellules endothéliales, les péricytes, cellules circulantes et les cellules stromales, des modèles in vitro restent limitées et ne peuvent pas récapituler le microenvironnement in vivo unique. Le principal des essais in vitro de l'angiogenèse sont en grande partie axées sur l'observation des effets directs sur les cellules endothéliales et de mesurer certaines étapes du processus angiogénique dans des conditions contrôlées. Ces analyses comprennent la quantification des cellules endothéliales prolifération une migration 2, la formation du réseau 3, formation du tube 4 et la germination de sphéroïdes 5. Modèles ex vivo, contrairement à celles in vitro, sont plus complexes et intégrer de multiples types de cellules des tissus, un exemple étant le test de l'anneau aortique 6. Néanmoins, comme d'autres systèmes, on ne peut pas capturer la contribution de cellules circulantes du stroma et des cellules endothéliales naturel que celui qui existe in vivo. Tentativespour étudier l'angiogenèse sous flux d'imiter la mise en vivo sont réalisés en utilisant des systèmes microfluidiques 7, mais même ces tests, bien que beaucoup sont améliorées, sont encore incapables de rendre compte de tous les compartiments existants in vivo.

En raison des limitations de l'in vitro et ex vivo de l'angiogenèse des modèles, des modèles in vivo restent les plus fiables de choix pour l'étude de l'angiogenèse. Des exemples de ces modèles comprennent l'implantation des chambres transparentes, des «fenêtres», qui permettent la visualisation des vaisseaux sanguins en croissance sous microscope 8, implants sous-cutanés injectables tels que matrigel et récipient formation dans les tissus normaux tels que l'oreille de la souris et la membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM ). Cependant, l'un des modèles les plus acceptables et quantitatives in vivo l'angiogenèse est l'essai de micropoche de néovascularisation de la cornée est décrit ici, qui exploite le naturellement avasculairecornée comme un «écran» de visualiser et d'évaluer une nouvelle croissance angiogénique 9.

Nous décrivons ici le test de micropoche cornéen développé chez la souris. Initialement, le modèle a été utilisé pour mesurer des stimuli angiogéniques non spécifiques dans les cornées de lapin. Cela a été fait par introduction des morceaux de tumeur dans l'humeur aqueuse de la chambre antérieure de l'œil de lapin et de mesurer la néovascularisation induite par une tumeur 11.

Cependant, l'essai a été plus tard évolué pour étudier les effets de croissance spécifique des facteurs 10 de mieux préciser et normaliser l'effet angiogénique. Afin de libérer le facteur de croissance de l'œil, des granulés à libération lente contenant des quantités connues de facteurs de croissance angiogéniques ont été utilisés à la place des tissus. La disponibilité de protéines angiogéniques recombinants purifiés tels que bFGF ou VEGF a permis leur utilisation comme objectifs spécifiques de modulaters de l'angiogenèse 12. Dans un premier temps, le dosage étaitlargement utilisé chez les lapins, qui sont plus faciles à travailler en raison de leur taille, mais plus tard, le modèle a été traduit dans des souris; un modèle animal plus petit et moins coûteux. Le passage de lapin à la souris fournit un avantage important d'être en mesure d'utiliser des animaux génétiquement modifiés, créant ainsi un nouveau domaine de recherche sur les composantes génétiques qui influent angiogenèse 13. En plus de l'utilisation plus acceptable de dosage de cornée dans l'étude de l'angiogenèse, d'autres processus biologiques peuvent également être étudiées en utilisant des tests modifiés. Par exemple, des études de la lymphangiogenèse ont été rendues possibles grâce à l'implantation de pastilles à faible dose bFGF qui a permis la visualisation des vaisseaux lymphatiques par marqueurs moléculaires spécifiques 14. En outre, cet essai a fourni un moyen pour évaluer les effets du rayonnement sur ​​l'angiogenèse 15.

En résumé, l'analyse de l'angiogenèse de la cornée micropoche est une quantitative, représentantroducible, évaluation souple de l'angiogenèse in vivo. Un avantage majeur de cette analyse est que le jaugeage des bateaux de fond n'est pas nécessaire parce que les vaisseaux se développent sur un tissu naturellement avasculaire. Nous décrivons ici le protocole de cet essai dans les détails et discuter de différents scénarios qui peuvent se produire. Le test se compose de 3 segments distincts. Ici, nous allons décrire la préparation de pastilles de facteur compris la croissance, l'implantation chirurgicale ultérieure, et finalement la méthode utilisée pour quantifier la croissance néovasculaire résultant.

Protocol

Tous les protocoles impliquant des animaux sont présentés et approuvés par le Comité de protection des animaux dans les institutions et l'utilisation de l'Hôpital pour enfants de Boston et sont menées en conformité avec les recommandations de l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des laboratoires de protection des animaux (AAALAC). Veillez à utiliser des instruments stériles et techniqure aseptique lors de l'exécution de la procédure. 1 Prépara…

Representative Results

Des résultats typiques pour le bFGF et VEGF pastilles dans les basses angiogéniques C57BL / 6J normaux sont présentés dans la figure 2A et B, respectivement. Figure 2E montre la distribution normale de la surface de la cuve (VA) dans la / souche 6J C57BL avec des doses variables de ceux-ci la croissance facteurs. 80 pastilles de bFGF ng entraînent normalement dans un VA d'environ 2,0 mm 2, si les valeurs dans une plage de 1,8-2,4 mm 2 sont…

Discussion

Il ya plusieurs étapes critiques dans la réalisation d'une analyse de la cornée réussie. La première consiste à créer des pastilles uniformes susceptibles d'être implanté et en stimulant les vaisseaux. Les parties les plus importantes de la préparation de granulés sont 1) en utilisant le facteur de croissance sans support; 2) assurer un bon mélange de facteur de croissance avec le sucralfate et hydron et 3) le déplacement du mélange final rapidement mais avec précaution du tube Eppendorf à la mai…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Kristin Johnson pour le travail graphique.

Materials

Section 1: Pellet preparation
Sucralfate Sigma #S0652
Hydron (aka Poly(2-Hema)) Sigma #P3932-10G
Ethanol Pharmco Products Inc #111000200CSGL
Growth factors: Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))
 Fibroblast growth factor (FGF) PeproTech #AF-100-18B
Vascular endothelial growth factor (VEGF) R & D Systems #293-VE-050/CF
35 mm dish Becton-Dickson #353001 Used for storage of pellets
10 cm petri dish VWR #25384-342 Used as work surface for preparing pellets
Mesh Sefar America #03–300/51 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave
Spatulas Fisher Scientific #21-401-10 Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific #05-408-146 One for hydron, one for sucralfate
Jewelers forceps, #5 Ambler Surgical #2315E Need 2 for pulling mesh apart
Centrifugal evaporator ThermoSavant DNA110 SpeedVac
Section 2: Surgical implantation of pellets
Operating microscope Zeiss
2.5% Avertin General anesthetic
Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% Falcon NDC# 6131401601 Eye anesthetic
Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment Bausch & Lomb NDC# 2420878055 Contains neomycin, polymixin and bacitracin
Ophthalmic microknife, 5 mm Surgistar #924501 30 degree angle
von Graef knife Ambler Surgical #3401E
Jewelers forceps, #1 Ambler Surgical #2301E Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye
Jewelers forceps, #5 Ambler Surgical #2305E For picking up pellets and placing on eye
Small curved scissors Ambler Surgical #5636E For trimming whiskers
Gauze For blotting eye after proparacaine
Section 3: Grading of Corneal Neovascularization
2.5% Avertin General anesthetic
Slit lamp Nikon FS-2 Needs an ocular with a reticule to assist in measuring

References

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Cite This Article
Birsner, A. E., Benny, O., D’Amato, R. J. The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (90), e51375, doi:10.3791/51375 (2014).

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