Роговицы Micropocket Анализ: Модель ангиогенеза в Mouse глаз
Summary
Протокол описывает роговицы micropocket определение, как разработанный на мышах.
Abstract
Мышь роговицы micropocket анализ является надежным и количественный анализ в естественных условиях для оценки ангиогенеза. С помощью стандартных медленным высвобождением гранулы, содержащие специфические факторы роста, которые вызывают рост кровеносных сосудов в течение всего естественно, лишенной сосудов роговицы, ангиогенез может быть измерено и количественно. В этом анализе ангиогенный ответ генерируется в течение нескольких дней, в зависимости от типа и дозы фактора роста используется. Индукция неоваскуляризации обычно вызваны либо основного фактора роста фибробластов (bFGF) или фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Комбинируя эти факторы роста с сукральфат и Hydron (поли-НЕМА (поли (2-гидроксиэтил метакрилат))) и отливки смеси в гранулы, они могут быть хирургически имплантированы в глаз мыши. Эти единые гранулы медленно-релиз факторы роста в течение пяти или шести дней (bFGF или VEGF соответственно) позволяет достаточно ангиогенную реакцию, необходимую для области судно дuantification помощью щелевой лампы. Этот анализ может быть использован для различных применений, в том числе оценки ангиогенных модулятора лекарств или лечения, а также сравнения разных генетических фонов, влияющих на ангиогенез. Квалифицированный следователь после практики этого анализа можно имплантировать гранул менее чем 5 мин на глаза.
Introduction
Процесс ангиогенеза, образование новых кровеносных сосудов образуют уже существующие те, в высшей степени сложным и регулируется с помощью нескольких эндогенных факторов, которые контролируют различные этапы прорастания сосудов и морфогенеза. Ангиогенез срабатывает за счет смещения в балансе между про-и анти-ангиогенеза факторов, баланса, что обычно ведет сосудистую в состоянии покоя. Ангиогенез у взрослых происходит в определенных физиологических условиях, таких как в женской яичников цикла или в репаративных процессов, таких как заживление ран и регенерации тканей. Тем не менее, это также отличительным признаком нескольких патологий в том числе злокачественных опухолей, аутоиммунных состояний и воспалительных заболеваний. Участие ангиогенеза в этих физиологических и патологических условиях делает его важным объектом для исследований и привлекательной мишенью для терапии.
В связи со сложностью ангиогенеза и привлечением нескольких сезаполняет и факторы в процессе, в том числе эндотелиальных клеток, перицитами, циркулирующих клеток и стромальных клеток, в пробирке модели остаются ограниченными и не могут резюмировать уникальную микросреду в естественных условиях. Основной в анализах пробирке ангиогенеза в значительной степени сосредоточены на наблюдении прямое воздействие на эндотелиальные клетки и измерение определенные шаги в процессе ангиогенеза в контролируемых условиях. Эти анализы включают количественную оценку пролиферации эндотелиальных клеток 1, миграции 2, формирование сети 3, формирование трубки 4 и прорастания от сфероидов 5. Экс естественных моделей, в отличие от тех в пробирке, являются более сложными и включать различные типы ткани клеток, примером чему кольца аорты анализ 6. Тем не менее, как и в других системах, он не может захватывать вклад циркулирующих клеток и естественную стромы эндотелиальных клеток, как существует в естественных условиях. Попыткиизучать ангиогенез в потоке, чтобы имитировать настройку в естественных условиях выполняются с помощью микрофлюидных системы 7, однако даже эти анализы, хотя значительно улучшилось, по-прежнему не в состоянии учесть все отсеки, существующих в естественных условиях.
В связи с ограничениями в пробирке и бывших естественных условиях моделей ангиогенеза, в естественных условиях модели остаются более надежные варианты для ангиогенеза исследований. Примерами таких моделей включают имплантацию прозрачных камер, "Windows", которые позволяют визуализировать растущих кровеносных сосудов под микроскопом 8, инъекционные подкожные имплантаты, такие как Матригель и сосудов образования в нормальных тканях, таких как уха мыши и курицы хориоаллантоисной мембране (CAM ). Тем не менее, одним из наиболее приемлемых и количественных моделей ангиогенеза в естественных условиях является роговицы micropocket неоваскуляризация анализ, описанный здесь, в которой использована, естественно, аваскулярныйРоговица как «экран», чтобы отследить и проанализировать новый ангиогенную рост 9.
Здесь мы опишем роговицы micropocket анализа, разработанные на мышах. Изначально модель была использована для измерения неспецифические ангиогенные стимулы в кролика роговицы. Это было сделано путем введения опухолевых части в водянистой влаги из передней камеры глаза кролика и измеряется индуцированного опухолью неоваскуляризацию 11.
Тем не менее, анализ был впоследствии превратилась для изучения последствий конкретного факторов роста 10 для лучшего определения и стандартизации ангиогенную эффект. Для того, чтобы освободить фактор роста в глаза, с медленным высвобождением гранулы, содержащие известные количества ангиогенных факторов роста были использованы вместо тканей. Наличие очищенных рекомбинантных ангиогенными белков, таких как bFGF или VEGF включен их использование в качестве конкретных задач ангиогенеза modulaters 12. Первоначально анализа былашироко используется в кроликов, которые легче работать с в силу своего размера, но позже модель была переведена на мышах; меньше и менее дорогой модели на животных. Переход от кролика мышам условии важное преимущество, которое позволяет использовать генетически манипулировать животных, создавая тем самым новую область исследований в генетических компонентов, влияющих ангиогенез 13. В дополнение к более приемлемым использование роговицы анализа в изучении ангиогенеза, другие биологические процессы также могут быть исследованы с использованием модифицированных анализов. Например, исследования лимфангиогенеза стали возможными благодаря имплантации гранулы с низким доза bFGF, которые позволили визуализацию лимфатических сосудов с помощью специальных молекулярных маркеров 14. Кроме того, это исследование служит средством для оценки воздействия радиации на ангиогенез 15.
В суммирования, роговицы micropocket ангиогенез анализ является количественная, представительroducible, гибкая оценка ангиогенеза в естественных условиях. Основным преимуществом этого анализа является то, что измерение фона сосудов является необходимым, так как сосуды растут на, естественно, лишенной сосудов ткани. Мы описываем здесь протокол этом анализе в деталях и обсудить различные сценарии, которые могут возникнуть. Анализ состоит из 3 отдельных сегментов. Здесь мы опишем приготовление фактор роста включено гранул, последующее хирургическую имплантацию и, наконец, метод, используемый для количественного определения результате неоваскулярную рост.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важных шагов в выполнении успешную роговицы анализа. Первый заключается в создании единых гранулы, способные быть имплантированы и стимулирования сосуды. Наиболее важные части подготовки гранул являются 1) с помощью носителя без фактора роста; 2) обеспечение хорошую сме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Кристин Джонсон для графических работ.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D’Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D’Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D’Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D’Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
