El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón
Summary
El protocolo describe el microensayo corneal como desarrollado en ratones.
Abstract
El ensayo de microbolsa de córnea de ratón es un ensayo robusto y cuantitativa in vivo para la evaluación de la angiogénesis. Mediante el uso de gránulos de liberación lenta estandarizadas que contienen factores de crecimiento específicos que activan el crecimiento de vasos sanguíneos a lo largo de la córnea avascular, naturalmente, la angiogénesis puede medirse y cuantificarse. En este ensayo se genera la respuesta angiogénica en el transcurso de varios días, dependiendo del tipo y la dosis del factor de crecimiento utilizado. La inducción de neovascularización son generalmente accionadas por cualquiera de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Mediante la combinación de estos factores de crecimiento con sucralfato y Hydron (poli-HEMA (poli (metacrilato de 2-hidroxietilo))) y la mezcla de fundición en forma de gránulos, que pueden ser implantados quirúrgicamente en el ojo del ratón. Estos gránulos uniformes lentamente a la liberación Los factores de crecimiento durante cinco o seis días (bFGF o VEGF, respectivamente) que permite suficiente respuesta angiogénica requerido para el área del vaso quantification usando una lámpara de hendidura. Este ensayo se puede utilizar para diferentes aplicaciones, incluyendo la evaluación de medicamentos o tratamientos moduladores angiogénicos así como la comparación entre los diferentes fondos genéticos que afectan a la angiogénesis. Un investigador experto después de practicar este ensayo puede implantar un pellet en menos de 5 min por ojo.
Introduction
El proceso de angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos se forman los preexistentes, es muy complejo y está regulado por varios factores endógenos que controlan diferentes etapas de germinación recipiente y la morfogénesis. La angiogénesis se activa debido a un cambio en el equilibrio entre los factores pro-y anti-angiogénicos, un equilibrio que mantiene normalmente la vasculatura en un estado de reposo. La angiogénesis en adultos se produce en ciertas condiciones fisiológicas, tales como durante el ciclo ovárico femenino o en los procesos de reparación, tales como la curación de heridas y regeneración de tejidos. Sin embargo, también es una característica de varias patologías, incluyendo tumores malignos, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias. La participación de la angiogénesis en estas condiciones fisiológicas y patológicas hace que sea un tema importante para la investigación y un blanco atractivo para la terapia.
Debido a la complejidad de la angiogénesis y la participación de varios cells y factores en el proceso, incluyendo las células endoteliales, pericitos, células circulantes y las células del estroma, in vitro modelos siguen siendo limitados y no pueden recapitular el microambiente único en vivo. La principal ensayos in vitro de la angiogénesis se centran en gran medida en la observación de efectos directos sobre las células endoteliales y la medición de ciertas medidas en proceso angiogénico en condiciones controladas. Estos ensayos incluyen la cuantificación de la proliferación celular endotelial 1, la migración 2, la formación de la red 3, la formación del tubo 4 y la brotación de esferoides 5. Modelos ex vivo, a diferencia de los in vitro, son más complejos e incorporar múltiples tipos de células de tejidos, siendo un ejemplo el ensayo de anillo aórtico 6. Sin embargo, como otros sistemas, no puede capturar la contribución de las células circulantes y el estroma natural de las células endoteliales como existe in vivo. Los intentospara estudiar la angiogénesis bajo flujo para imitar el entorno in vivo se llevan a cabo utilizando sistemas de microfluidos 7, sin embargo, incluso estos ensayos, aunque ha mejorado mucho, todavía son incapaces de dar cuenta de todos los compartimentos existentes en vivo.
Debido a las limitaciones de la ex vivo modelos de angiogénesis in vitro y en modelos in vivo siguen siendo las opciones más fiables para los estudios de la angiogénesis. Ejemplos de estos modelos incluyen la implantación de cámaras transparentes, "Windows", que permiten la visualización de los vasos sanguíneos que crecen bajo microscopio de 8, implantes subcutáneos inyectables tales como matrigel y recipiente de formación en tejidos normales tales como oreja de ratón y la membrana corioalantoidea de pollo (CAM ). Sin embargo, uno de los modelos de angiogénesis in vivo más aceptables y cuantitativos es el ensayo de neovascularización corneal microbolsa se describe aquí, que aprovecha la natural avascularcórnea como una "pantalla" para visualizar y evaluar el nuevo crecimiento angiogénico 9.
Aquí se describe el ensayo de microbolsa corneal como desarrollado en ratones. Inicialmente, el modelo se utilizó para medir los estímulos angiogénicos no específicos en córneas de conejo. Esto se hizo mediante la introducción de piezas de tumor en el humor acuoso de la cámara anterior del ojo del conejo y se mide la neovascularización inducida por tumor 11.
Sin embargo, el ensayo se desarrolló más tarde para estudiar los efectos de factores de crecimiento específico 10 para especificar y estandarizar el efecto angiogénico mejor. Con el fin de liberar el factor de crecimiento en el ojo, se usaron gránulos de liberación lenta que contienen cantidades conocidas de los factores de crecimiento angiogénicos en lugar de tejidos. La disponibilidad de proteínas recombinantes purificadas angiogénicos tales como bFGF o VEGF activar su uso como objetivos específicos de la angiogénesis modulaters 12. Inicialmente, el ensayo seutilizado en gran medida en los conejos, que son más fáciles de trabajar debido a su tamaño, pero más tarde el modelo fue traducido en ratones; un modelo animal más pequeño y menos caro. El cambio de conejo a ratones proporcionan una importante ventaja de ser capaz de utilizar animales manipulados genéticamente, creando así una nueva área de investigación sobre los componentes genéticos que afectan la angiogénesis 13. Además del uso más aceptable de ensayo de la córnea en el estudio de la angiogénesis, otros procesos biológicos también pueden ser investigados utilizando ensayos modificados. Por ejemplo, se realizaron estudios de linfangiogénesis posible a través de la implantación de gránulos de bajas dosis de bFGF que permitieron la visualización de los vasos linfáticos a través de marcadores moleculares específicos 14. Además, este ensayo ha proporcionado un medio para evaluar los efectos de la radiación sobre la angiogénesis 15.
En resumen, el ensayo de angiogénesis microbolsa corneal es una cuantitativa, reproducible, evaluación flexible de la angiogénesis in vivo. Una ventaja importante de este ensayo es que la medición de los buques de fondo es innecesaria porque los vasos crecen en un tejido avascular naturalmente. Se describe aquí el protocolo de este ensayo en los detalles y discutir diferentes escenarios que pueden ocurrir. El ensayo consta de 3 segmentos discretos. Aquí vamos a describir la preparación de gránulos de factor de crecimiento incluido, la implantación quirúrgica posterior y, finalmente, el método utilizado para cuantificar el crecimiento neovascular resultante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos críticos en la realización de un exitoso ensayo de la córnea. El primero es hacer gránulos uniformes capaces de ser implantado y la estimulación de los vasos. Las partes más importantes de la preparación de pellets son: 1) el uso del factor de crecimiento sin vehículo; 2) garantizar una buena mezcla de factores de crecimiento con el sucralfato y hydron y 3) que se mueve la mezcla final con rapidez pero con cuidado del tubo Eppendorf a la malla donde se echan los pellets. Se recomienda que los pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Kristin Johnson para la obra gráfica.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D’Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D’Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D’Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D’Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
