Il corneale MICROPOCKET Assay: Un modello di angiogenesi nel Eye mouse
Summary
Il protocollo descrive il dosaggio micropocket corneale come sviluppato nei topi.
Abstract
Il mouse corneale MICROPOCKET test è un test robusto e quantitativa in vivo per valutare l'angiogenesi. Utilizzando pellet a lento rilascio standardizzate, contenenti fattori di crescita specifici che innescano la crescita dei vasi sanguigni in tutta la cornea naturalmente avascolare, angiogenesi può essere misurato e quantificato. In questo test la risposta angiogenica è generato nel corso di diversi giorni, a seconda del tipo e della dose di fattore di crescita utilizzato. L'induzione di neovascolarizzazione è comunemente attivata tramite fattore fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) o fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Combinando questi fattori di crescita con sucralfato e hydron (poly-HEMA (poli (metacrilato di 2-idrossietil))) e colare il composto in pellet, possono essere impiantati chirurgicamente nell'occhio topo. Questi pellet uniformi lentamente rilasciano i fattori di crescita nell'arco di cinque o sei giorni (bFGF o VEGF, rispettivamente) consentendo risposta angiogenica sufficiente richiesta per zona nave quantification utilizzando una lampada a fessura. Questo test può essere utilizzato per diverse applicazioni, tra cui la valutazione dei farmaci modulatori angiogenici o trattamenti così come il confronto tra diversi background genetici che influenzano l'angiogenesi. Un investigatore esperto dopo aver praticato questo test può impiantare una pallina in meno di 5 minuti per occhio.
Introduction
Il processo di angiogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni formano quelle preesistenti, è molto complesso ed è regolato da diversi fattori endogeni che controllano le diverse fasi di germinazione nave e morfogenesi. L'angiogenesi è attivato a causa di un cambiamento di equilibrio tra fattori pro e anti-angiogenici, un equilibrio che mantiene normalmente la vascolarizzazione in stato di quiescenza. Angiogenesi negli adulti si verifica in determinate condizioni fisiologiche, come durante il ciclo ovarico femminile o nei processi di riparazione come la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti. Tuttavia, è anche una caratteristica di molte patologie tra cui tumori, malattie autoimmuni e malattie infiammatorie. Il coinvolgimento di angiogenesi in queste condizioni fisiologiche e patologiche rende un tema importante per la ricerca e un bersaglio attraente per la terapia.
A causa della complessità di angiogenesi e il coinvolgimento di vari ceLLS e fattori nel processo, comprese le cellule endoteliali, periciti, cellule circolanti e cellule stromali, in vitro modelli restano limitate e non possono ricapitolare il microambiente unico in vivo. Il principale test in vitro di angiogenesi sono in gran parte concentrati sull'osservazione effetti diretti sulle cellule endoteliali e misurare alcuni passi nel processo angiogenetico in condizioni controllate. Questi test includono la quantificazione della proliferazione delle cellule endoteliali 1, 2 migrazione, formazione rete 3, la formazione del tubo 4 e germinazione da sferoidi 5. Ex vivo i modelli, a differenza di quelli in vitro, sono più complessi e integrare più tipi di cellule dei tessuti, un esempio è il test dell'anello aortico 6. Tuttavia, come altri sistemi, non può catturare il contributo delle cellule circolanti e lo stroma naturale delle cellule endoteliali come esiste in vivo. Tentatividi studiare l'angiogenesi in condizioni di flusso per imitare l'impostazione in vivo vengono eseguite con sistemi microfluidici 7, tuttavia anche questi test, anche se molto migliorata, sono ancora in grado di spiegare tutti i comparti esistenti in vivo.
A causa delle limitazioni del ex vivo in modelli angiogenesi in vitro e in vivo modelli rimangono le scelte più affidabili per Studi angiogenesi. Esempi di questi modelli includono l'impianto di camere trasparenti, "finestre", che consentono la visualizzazione di crescita dei vasi sanguigni sotto il microscopio 8, impianti sottocutanei iniettabili come matrigel e vaso formazione nei tessuti normali come mouse orecchio e la membrana corioallantoidea pollo (CAM ). Tuttavia, uno dei modelli di angiogenesi più accettabili e quantitativi in vivo è il test MICROPOCKET neovascolarizzazione corneale qui descritta, che sfrutta la natura avascolarecornea come "schermo" per visualizzare e valutare la nuova crescita angiogenico 9.
Qui si descrive il test MICROPOCKET corneale come sviluppato nei topi. Inizialmente il modello è stato utilizzato per misurare non specifici stimoli angiogenici in cornee di coniglio. Ciò è stato fatto introducendo pezzi tumorali nell'umore acqueo della camera anteriore dell'occhio di coniglio e misurato neoplastica neovascolarizzazione 11.
Tuttavia, il test è stato successivamente evoluto per studiare gli effetti di specifici fattori di crescita 10 per specificare e standardizzare l'effetto angiogenico meglio. Al fine di rilasciare il fattore di crescita nell'occhio, pellet lento rilascio contenenti quantità note di fattori di crescita angiogenici sono stati usati al posto dei tessuti. La disponibilità di proteine purificate ricombinanti angiogenici come il bFGF e VEGF attivato il loro uso come obiettivi specifici di modulaters angiogenesi 12. Inizialmente, il test è statoin gran parte utilizzato nei conigli, che sono più facili da lavorare con causa delle loro dimensioni, ma in seguito il modello è stato tradotto in topi; un modello animale più piccolo e meno costoso. Il passaggio da coniglio topi fornito un importante vantaggio di poter utilizzare animali geneticamente manipolati, creando così una nuova area di ricerca sulle componenti genetiche che influenzano l'angiogenesi 13. Oltre all'utilizzo più accettabile di dosaggio cornea nello studio angiogenesi, altri processi biologici possono anche indagati mediante saggi modificati. Ad esempio, gli studi di linfoangiogenesi sono stati resi possibili attraverso l'impianto di pellet a basso dosaggio bFGF che hanno permesso la visualizzazione dei vasi linfatici attraverso marcatori molecolari specifici 14. Inoltre, questo test ha fornito un mezzo per valutare gli effetti delle radiazioni sulla angiogenesi 15.
In somma, la corneale test MICROPOCKET angiogenesi è una quantitativa, rappresentanteroducible, la valutazione flessibile di angiogenesi in vivo. Uno dei principali vantaggi di questo test è che la misurazione delle navi di fondo è inutile perché i vasi crescono su un tessuto avascolare naturalmente. Descriviamo qui il protocollo di questo saggio nei dettagli e discutere diversi scenari che possono verificarsi. Il test consiste di 3 segmenti discreti. Qui descriveremo la preparazione di crescita pellet fattore-inclusive, il successivo impianto chirurgico e, infine, il metodo utilizzato per quantificare la crescita neovascolare risultante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi passaggi critici in esecuzione di un test corneale successo. Il primo è fare pellet uniformi in grado di essere impiantati e stimolando i vasi. Le parti più importanti di preparazione pellet sono 1) con fattore di crescita senza vettore; 2) garantire una buona miscela di fattore di crescita con il sucralfato e hydron e 3) spostando la miscela finale rapidamente ma con cura dal tubo eppendorf alla maglia in cui sono espressi i pellet. Si consiglia di pellet "virtuali" essere fatte senza fattor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Kristin Johnson per il lavoro grafico.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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