각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델
Summary
이 프로토콜은 생쥐에서 개발로 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
마우스 각막 micropocket 분석은 혈관 형성을 평가하기위한 강력하고 정량적 생체 분석이다. 무 혈관 각막에 걸쳐 자연적으로 혈관의 성장을 유발 특정 성장 인자를 포함하는 표준화 된 서방 형 펠렛을 사용함으로써, 혈관 신생을 측정 및 정량화 될 수있다. 본 분석에서 사용되는 혈관 신생 반응은 성장 인자의 종류와 양에 따라 몇 일에 걸쳐 발생된다. 신생 혈관의 유도는 일반적으로 하나 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 의해 트리거된다. hydron 및 수크 랄 페이트 (폴리-HEMA (폴리 (2 – 히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트))) 및 펠릿 혼합물을 캐스팅 이들 성장 인자를 조합하여, 그들은 수술 마우스 눈에 이식 될 수있다. 이러한 균일 한 펠릿을 용기 영역 Q에 필요한 충분한 혈관 반응을 가능하게 (각각의 bFGF 또는 VEGF) 대여섯 일 동안 성장 인자를 느리게 출시슬릿 램프를 사용하여 uantification. 이 분석은 혈관 신생 변조기 약물이나 치료법뿐만 아니라 혈관 형성에 영향을 미치는 유전 적 배경을 가지의 비교 평가를 포함한 다양한 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 분석을 연습 후 숙련 된 조사관이 눈 미만 5 분의 펠렛을 이식 할 수 있습니다.
Introduction
혈관 신생 과정은 새로운 혈관의 형성은 기존의 것들을 형성, 매우 복잡하고 혈관 발아와 형태 형성의 여러 단계를 제어하는 여러 내인성 인자에 의해 조절된다. 혈관 신생 인해 프로 및 항 – 혈관 신생 인자의 균형의 변화, 통상적으로 정지 상태를 유지 맥관 밸런스에 트리거된다. 성인의 혈관 신생은 여성의 난소주기 동안이나 같은 상처 치유 및 조직 재생 등의 수리 과정에서 특정 생리 학적 조건에서 발생합니다. 그러나, 또한 악성 종양,자가 면역 질환 및 염증성 상태를 포함한 여러 병리 상태의 특징이다. 이러한 생리 학적 및 병리학 적 상태에서 혈관 신생의 참여는 연구와 치료를위한 매력적인 대상의 중요한 주제 있습니다.
때문에 혈관의 복잡성과 여러 가전의 참여에모델을 한정 남아 독특한 생체 미세 요점을 되풀이 할 수 관내 내피 세포, 혈관 주위 세포, 순환 세포와 간질 세포를 포함하는 과정에서 LLS와 요인. 혈관 신생의 체외 분석의 주요 크게 내피 세포에 직접적인 영향을 관찰하고 통제 된 조건에서 혈관 신생 과정의 특정 단계를 측정에 초점을 맞추고있다. 이러한 분석법은 내피 세포 증식 1, 마이그레이션이, 네트워크 형성 3, 관 형성 (4)의 정량화 및 타원체 5 돋아을 포함한다. 생체 내 모델을 시험 관내 것과 달리, 더 복잡하고 다양한 조직 세포 유형을 포함, 예 되 대동맥 링 분석 6. 생체에 존재하는 역시, 다른 시스템과 마찬가지로 순환 세포의 기여 및 내피 세포의 천연 기질을 캡처 할 수있다. 시도많은 개선되지만, 마이크로 유체 시스템 (7)을 사용하여 수행되는 생체 내 세팅 그러나 심지어 이러한 분석법을 모방 흐름 하에서 혈관 신생을 연구, 생체 내에서 여전히 존재하는 모든 구획을 설명 할 수 없다.
인해 시험 관내 및 생체 외에서 혈관 신생 모델의 한계로 생체 내 혈관 신생 모델 연구에 대한보다 안정적인 선택 남아있다. 이러한 모델의 예는 현미경 8 미만 성장하는 혈관의 시각화를 허용 투명한 챔버, "윈도우"의 주입을 포함, 예컨대 마우스 귀 및 닭 융모 막과 같은 정상 조직에있는 매트 리겔 및 혈관 형성과 같은 주사 피하 임플란트 (CAM ). 그러나, 대부분의 허용 및 정량 생체 내 혈관 신생 모델 중 하나는 자연적 무혈성 이용한다 여기서 설명 micropocket 각막 신생 혈관 분석이며,"화면"으로 각막 시각화하고 새로운 혈관 성장을 구를 평가합니다.
생쥐에서 개발로 여기에서 우리는 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다. 초기 모델 토끼 각막 혈관 신생 비특이적 자극을 측정 하였다. 이 토끼 눈의 전방의 방수에 종양 조각을 도입하여 수행 종양에 의한 혈관 신생 (11)을 측정 하였다.
그러나, 분석은 나중에 더 나은 지정하고 혈관 신생 효과를 표준화하기 위해 특정 성장의 효과를 연구하기 위해 열 요인 진화했다. 눈에 성장 인자를 분리하기 위하여, 혈관 신생 성장 인자의 공지 된 양을 함유하는 서방 형 펠렛 대신 원단으로 사용 하였다. 등의 bFGF 또는 VEGF와 같은 정제 된 재조합 혈관 형성 단백질의 가용성은 혈관 신생 modulaters (12)의 특정 대상으로 사용을 활성화. 초기에, 분석했다대부분의 크기로 인해 나중에 모델이 마우스로 번역 작업하기 쉽게 토끼에 사용; 더 작고 덜 비싼 동물 모델. 마우스에 토끼로부터 이동시켜 혈관 (13)에 영향을 미치는 유전 적 구성 요소에 대한 연구의 새로운 영역을 생성, 유전자 조작 된 동물을 사용 할 수 있다는 중요한 장점을 제공했다. 혈관 신생 연구에서 각막 분석의 더 이용 목적에 더하여, 다른 생물학적 과정은 또한 수정 된 분석법을 사용하여 조사되고있다. 예를 들어, 림프관의 연구는 특정 분자 마커 (14)를 통해 림프 혈관의 시각화를 허용 저용량의 bFGF 펠렛의 주입을 통해 가능하게되었다. 또한,이 분석은 혈관 (15) 상에 방사선의 효과를 평가하는 수단을 제공했다.
요약하면, 각막의 혈관 신생 micropocket 분석은 정량적, 담당자는roducible, 생체 내에서 혈관을 유연하게 평가. 이 분석의 주요 장점은 용기가 자연스럽게 무 혈관 조직에서 성장하기 때문에 배경 혈관의 측정이 필요하다는 것이다. 우리는 여기에서 자세한 내용이 분석의 프로토콜을 설명하고 발생할 수있는 다양한 시나리오에 대해 설명합니다. 분석은 3 이산 세그먼트로 구성되어 있습니다. 여기에서는 생성 된 신생 혈관 성장을 정량화하는 데 사용되는 성장 인자를 포함하는 펠릿의 제조에, 후속 수술 이식 최종적 방법을 서술한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적인 각막 분석을 수행하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 이식되는 선박을 자극 할 수있는 균일 한 알약을하고있다. 펠릿 제조의 가장 중요한 부분)은 반송파없이 성장 인자를 사용하는 일이다; 2) 펠릿 주조 메쉬 에펜 도르프 튜브에서 신속하지만 신중 최종 혼합물을 이동) 및 수크 랄 페이트 hydron 3과 성장 인자의 양호한 혼합을 보장한다. 그것은 "더미"펠릿 기술을 연?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그래픽 작업을 위해 크리스틴 존슨 감사합니다.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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