Hvem er hvem? Ikke-invasive metoder til individuelt Sex og Mark Altricial Chicks
Summary
Denne protokol giver en bekvem sæt af metoder, der gør det muligt ekstremt hurtig, nem, non-invasive, pålidelig og billig, molekylær kønsbestemmelse af fugle og deres ikke-invasiv, hurtig, sikker og let genkendelig mærkning kort tid efter klækning. Kun begrænset håndtering af kyllinger er påkrævet. Denne bekvemme værktøjskasse af metoder opfylder helt med RRR-retningslinjer.
Abstract
Mange eksperimenter kræve tidlig bestemmelse af afkom køn samt tidlig mærkning af nyfødte for individuel anerkendelse. Ifølge retningslinjer for dyrevelfærd bør ikke-invasive teknikker blive foretrukket, når det er relevant. I vores gruppe arbejder vi på forskellige arter af sangfugle i laboratoriet og i marken, og vi med succes anvende ikke-invasive metoder til sex og individuelt markere kyllinger. Denne artikel præsenterer en omfattende ikke-invasiv værktøjskasse. Kønsbestemmelse fugle før ekspression af sekundære seksuelle træk kræver indsamling af DNA-bærende materiale til PCR. Vi har etableret en hurtig og nem metode til sex fugle af enhver alder (post udklækning) ved at udvinde DNA fra buccale svaberprøver. Resultater kan opnås inden for 3 timer. For individuel mærkning chick s dun er trimmet i bestemte mønstre giver hurtig identifikation inden udklækning orden. Dette sæt af metoder er let anvendelig i en standard udstyret laboratorium og specielt velegnet til Working på banen, da ikke særligt udstyr er påkrævet for prøveudtagning og opbevaring. Håndtering af kyllinger minimeres og mærkning og kønsbestemmelse teknikker er ikke-invasiv derved understøtte RRR-princippet om retningslinjer for dyrevelfærd.
Introduction
Individuel anerkendelse, kønsbestemmelse og genotypebestemmelse er grundlæggende forudsætninger i en lang række eksperimentelle studier. Indhentning af DNA bærende materiale og mærkning emner entydigt (selv i en tidlig alder) bør have minimal indflydelse på fysiologi, adfærd og overlevelse. Når det er muligt, bør invasive procedurer undgås i henhold til RRR princip 1..
Ikke-invasive metoder er ikke kun til gavn for dyret, men også kan forbedre de opnåede data dyr påvirkes mindre af behandlingerne.
Hos fugle kan DNA kønsbestemmelse udføres på en række ikke-invasivt opnåelige materialer som ekskrementer 2, fjer 3,4 eller bukkale podninger 3,5,9. Uanset fagets tilstand og alder buccale svaberprøver er den foretrukne metode for aviær kønsbestemmelse, fordi de er nemme at udføre, sjældent mislykkes og håndtering er kort.
Hidtil DNA fra buccale svaberprøverenten blev ekstraheret med kommercielt tilgængelige kits 3,6 eller tidskrævende standard DNA ekstraktionsprotokoller 3,6-8. Kits er ikke kun temmelig dyrt, men deres protokoller kan pålægge udfordringer for markarbejde. Nogle proceduremæssige detaljer, fx tørring og inkubation af prøver, er ikke praktisk i marken. Især i en indstilling, hvor forsøgsprotokoller kræver sex afhængig behandling fra så tidligt som et par minutter efter udklækning, er der trang til en hurtig, non-invasive, pålidelig og nem metode til at opnå resultater.
På tværs af aviær taxa en betydelig værktøjskasse til mærkning individer er blevet udviklet 10. Den brede vifte af tilgængelige teknikker tegner sig for de forskellige forsknings målsætninger, arter og budgetter. Men mærkning små unger har konfronteret forskere med ekstra udfordringer. I nogle arter (f.eks spurvefugle) kyllinger er for små til at anvende ben bands og kræver alternative metoder, somikke ændrer forældre-afkom adfærd. Som bevidsthed og interesse i at forbedre dyrevelfærd og teknikker i marken og laboratorieundersøgelser er stigende, er brugen af ikke-invasive teknikker opfordres kraftigt og foretrækkes.
Denne protokol giver en non-invasiv, hurtig, let genkendelig og vedvarende metode til individuelt at markere meget unge unger, før du anvender benbånd er muligt. Denne mærkning metode indføres på en af de vigtigste fugle laboratorium modelarter, Zebra Finch (Taeniopygia guttata) 11-13. Protokollen overholder alle de tidligere offentliggjorte mål for de enkelte mærkning teknikker 10 og er allerede blevet anvendt med succes 14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kønsbestemmelse fra buccale svaberprøver hjælp Chelex viste en meget høj succesrate. Skæring Hatchling s dun aktiveret differentiering mellem unger indtil benet banding var muligt.
Chelex-DNA-ekstraktion fra buccale podninger viste nok DNA til med succes at udføre molekylær kønsbestemmelse. Kønsbestemmelse var 100% korrekt som valideret seksuelt dimorfe fjerdragt. Succesraten rapporteret her er markant højere end den sats, rapporteret af to tidligere studier 7,9. DNA eks…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mange tak til Silke Kipper, Sarah Kiefer, Michael Weiß, Conny Bartsch og Silke Voigt-Heucke for entusiastiske prøvetagning i marken, til Janett Birkenfeld for fortsat bistand, Ulla Kobalz for de smukke geler og Tobias Krause for moralsk støtte.
Materials
| Whatman 3MM Chromatography paper | e.g. Fisher Scientific | No.:3030-153 | |
| Chelex 100 Resin | Biorad | #143-2832 | |
| Taq polymerase | addgene | http://www.addgene.org/25712/ | |
| leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2,5 mm) | Horst Stengel & Sohn |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , (1959).
- Robertson, B. C., et al. Molecular sexing of individual kakapo, Strigops habroptilus Aves, from feces. Mol. Ecol. 8, 1349-1350 (1999).
- Yannic, G., et al. Description of microsatellite markers and genotyping performances using feathers and buccal swabs for the Ivory gull (Pagophila eburnea). Mol. Ecol. Resour. 11, 877-889 (2011).
- Bello, N., et al. Isolation of genomic DNA from feathers. J. Vet. Diagn. Invest. 13, 162-164 (2001).
- Handel, C. M., et al. Use of buccal swabs for sampling DNA from nestling and adult birds. Wildl. Soc. Bull. 34, 1094-1100 (2006).
- Brubaker, J. L., et al. A noninvasive, direct real-time PCR method for sex determination in multiple avian species. Mol. Ecol. Resour. 11, 415-417 (2011).
- Arima, H., Ohnishi, N. Usefulness of avian buccal cells for molecular sexing. Ornithological Science. 5, 139-143 (2006).
- Seki, S. -. I. Molecular sexing of individual Ryukyu Robins Erithacus komadori using buccal cells as a non-invasive source of DNA. Ornithological Science. 2, 135-137 (2003).
- Wellbrock, A. H. J., et al. Buccal swabs as a reliable source of DNA for sexing young and adult Common Swifts (Apus apus). J. Ornithol. 153, 991-994 (2012).
- Marion, W. R., Shamis, J. D. Annotated-Bibliography of Bird Marking Techniques. Bird Banding. 48, 42-61 (1977).
- Scharff, C., Adam, I. Neurogenetics of birdsong. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Griffith, S. C., Buchanan, K. L. The Zebra Finch: the ultimate Australian supermodel. Emu. 110, 5-12 (2010).
- Fee, M. S., Scharff, C. The songbird as a model for the generation and learning of complex sequential behaviors. Ilar J. 51, 362-377 (2010).
- Honarmand, M., et al. Stressful dieting: nutritional conditions but not compensatory growth elevate corticosterone levels in zebra finch nestlings and fledglings. PLoS On. 5, (1371).
- Krause, E. T., et al. Zebra finch nestlings beg more under better nutritional conditions. Behaviour. 148, 1239-1255 (2011).
- Griffiths, R., et al. A DNA test to sex most birds. Mol. Ecol. 7, 1071-1075 (1998).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21, 4850-4851 (1993).
- . Joint Working Group on Refinement. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 35, 1-163 (2001).
