Wie is wie? Niet-invasieve methoden om Individueel Sex en Mark Altricial Chicks
Summary
Dit protocol biedt een handige set van methoden, die extreem snel, gemakkelijk, niet-invasieve, betrouwbare en goedkope maakt, moleculaire geslachtsbepaling van vogels en hun niet-invasief, snel, veilig en gemakkelijk herkenbare markering kort na het uitkomen. Slechts beperkte behandeling van kuikens is vereist. Deze handige gereedschapskist van methoden voldoet volledig bij de RRR-richtlijnen.
Abstract
Veel experimenten vereisen vroege bepaling van het geslacht nakomelingen evenals vroege markeren van pasgeborenen voor individuele erkenning. Volgens de richtsnoeren voor dierenwelzijn, moeten niet-invasieve technieken de voorkeur wanneer van toepassing. In onze groep werken we op verschillende soorten zang vogels in het lab en in het veld, en we met succes non-invasieve methoden toepassen om seks en individueel markeren kuikens. Dit document presenteert een uitgebreid non-invasieve gereedschapskist. Geslachtsbepaling vogels voorafgaand aan de expressie van secundair seksuele kenmerken vereist het verzamelen van DNA-dragende materiaal voor PCR. We hebben een snelle en eenvoudige methode om seks vogels van elke leeftijd (na het uitbroeden) door extractie van DNA uit buccale swabs. Resultaten kunnen worden bereikt binnen 3 uur. Voor donsveren individuele markering kuiken zijn bekleed met specifieke patronen zorgt voor een snelle identificatie binnen het uitkomen bestelling. Deze set van methoden is gemakkelijk toepasbaar in een standaard uitgeruste lab en in het bijzonder geschikt voor working het veld geen speciale apparatuur nodig voor bemonstering en opslag. Afhandeling van kuikens wordt geminimaliseerd en markering en geslachtsbepaling technieken zijn niet-invasieve waardoor de RRR-principe van de richtsnoeren voor dierenwelzijn ondersteunen.
Introduction
Individuele erkenning, sexen en genotypering zijn fundamentele vereisten in een verscheidenheid van experimentele studies. Het verkrijgen van DNA lagermateriaal en opschriften onderwerpen ondubbelzinnig (zelfs op jonge leeftijd) moeten minimaal effect op de fysiologie, gedrag en overleving. Waar mogelijk moet invasieve procedures worden vermeden volgens de RRR principe 1.
Niet-invasieve methoden zijn niet alleen nuttig voor het dier, maar ook kan de verkregen gegevens verbeteren dieren minder beïnvloed door de behandelingen.
Bij vogels kan DNA sexen worden uitgevoerd op een aantal niet-invasief verkrijgen materialen uitwerpselen 2, veren 3,4 of buccale uitstrijkjes 3,5,9. Ongeacht de conditie en leeftijd speekselmonsters onderwerp zijn de methode van keuze voor aviaire geslachtsbepaling, want ze zijn eenvoudig uit te voeren, zelden mislukken en de behandeling is kort.
Tot nu toe, DNA van buccale uitstrijkjeswas ofwel geëxtraheerd met commercieel verkrijgbare kits 3,6 of tijdrovend standaard DNA-extractie protocols 3,6-8. Kits zijn niet alleen vrij duur, maar hun protocollen kunnen uitdagingen opleggen voor veldwerk. Sommige proceduredetails, zoals drogen en incubatie van de monsters, zijn niet praktisch in het veld. Vooral in een omgeving waar de experimentele protocollen vereisen sex afhankelijk behandeling al vanaf een paar minuten na uitkomen, er is dringen voor een snelle, niet-invasieve, betrouwbare en eenvoudige methode om resultaten te verkrijgen.
Aan de overkant van de aviaire taxa een aanzienlijke toolbox voor het markeren van individuen is ontwikkeld 10. Het brede scala van beschikbare technieken goed voor de verscheidenheid van de onderzoeksdoelstellingen, soorten en budgetten. Echter, het markeren van kleine nestjongen heeft onderzoekers met extra uitdagingen geconfronteerd. In sommige soorten (bijv. passerines) kuikens te klein om beenbanden passen en vereisen alternatieve werkwijzen dieveranderen niets aan ouder-nakomelingen gedrag. Naarmate het bewustzijn en interesse in het verbeteren van het welzijn en technieken in het veld en laboratoriumstudies dier groeit, wordt het gebruik van niet-invasieve technieken sterk aangemoedigd en voorkeur.
Dit protocol voorziet in een niet-invasieve, snel, gemakkelijk herkenbaar en hardnekkig methode om individueel markeren zeer jonge nestjongen alvorens beenbanden haalbaar is. Deze markering methode wordt ingevoerd op een van de belangrijkste aviaire laboratorium model soorten, de zebravink (Taeniopygia guttata) 11-13. Het protocol voldoet aan alle van de eerder gepubliceerde doelstellingen voor individuele markeringstechnieken 10 en is reeds met succes toegepast 14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geslachtsbepaling van buccale swabs gebruik Chelex toonde een zeer hoog slagingspercentage. Donsveren snijden hatchling ingeschakeld onderscheid tussen nestjongen tot been banding mogelijk was.
Chelex-DNA-extractie van speekselmonsters leverde genoeg DNA om moleculaire geslachtsbepaling succes uit te voeren. Geslachtsbepaling was 100% correct zijn gevalideerd door seksueel dimorf verenkleed. Het slagingspercentage hier gemeld is aanzienlijk hoger dan het percentage gemeld door twee eerdere s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Veel dank aan Silke Kipper, Sarah Kiefer, Michael Weiß, Conny Bartsch en Silke Voigt-Heucke naar enthousiaste monstername in het veld, om Janett Birkenfeld voor verdere hulp, om Ulla Kobalz voor de mooie gels en Tobias Krause voor morele steun.
Materials
| Whatman 3MM Chromatography paper | e.g. Fisher Scientific | No.:3030-153 | |
| Chelex 100 Resin | Biorad | #143-2832 | |
| Taq polymerase | addgene | http://www.addgene.org/25712/ | |
| leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2,5 mm) | Horst Stengel & Sohn |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , (1959).
- Robertson, B. C., et al. Molecular sexing of individual kakapo, Strigops habroptilus Aves, from feces. Mol. Ecol. 8, 1349-1350 (1999).
- Yannic, G., et al. Description of microsatellite markers and genotyping performances using feathers and buccal swabs for the Ivory gull (Pagophila eburnea). Mol. Ecol. Resour. 11, 877-889 (2011).
- Bello, N., et al. Isolation of genomic DNA from feathers. J. Vet. Diagn. Invest. 13, 162-164 (2001).
- Handel, C. M., et al. Use of buccal swabs for sampling DNA from nestling and adult birds. Wildl. Soc. Bull. 34, 1094-1100 (2006).
- Brubaker, J. L., et al. A noninvasive, direct real-time PCR method for sex determination in multiple avian species. Mol. Ecol. Resour. 11, 415-417 (2011).
- Arima, H., Ohnishi, N. Usefulness of avian buccal cells for molecular sexing. Ornithological Science. 5, 139-143 (2006).
- Seki, S. -. I. Molecular sexing of individual Ryukyu Robins Erithacus komadori using buccal cells as a non-invasive source of DNA. Ornithological Science. 2, 135-137 (2003).
- Wellbrock, A. H. J., et al. Buccal swabs as a reliable source of DNA for sexing young and adult Common Swifts (Apus apus). J. Ornithol. 153, 991-994 (2012).
- Marion, W. R., Shamis, J. D. Annotated-Bibliography of Bird Marking Techniques. Bird Banding. 48, 42-61 (1977).
- Scharff, C., Adam, I. Neurogenetics of birdsong. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Griffith, S. C., Buchanan, K. L. The Zebra Finch: the ultimate Australian supermodel. Emu. 110, 5-12 (2010).
- Fee, M. S., Scharff, C. The songbird as a model for the generation and learning of complex sequential behaviors. Ilar J. 51, 362-377 (2010).
- Honarmand, M., et al. Stressful dieting: nutritional conditions but not compensatory growth elevate corticosterone levels in zebra finch nestlings and fledglings. PLoS On. 5, (1371).
- Krause, E. T., et al. Zebra finch nestlings beg more under better nutritional conditions. Behaviour. 148, 1239-1255 (2011).
- Griffiths, R., et al. A DNA test to sex most birds. Mol. Ecol. 7, 1071-1075 (1998).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21, 4850-4851 (1993).
- . Joint Working Group on Refinement. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 35, 1-163 (2001).
