מי הוא מי? שיטות לא פולשנית בנפרד כדי סקס ואפרוחים חובשי קן מארק
Summary
פרוטוקול זה מספק ערכה נוחה של שיטות, אשר מאפשרת מהיר מאוד, קל, לא פולשנית, אמין ובעלות נמוכה, נחישות מולקולרית מין של ציפורים ולא פולשנית מהירה, בטוח וקלה לזיהוי לסימונם, זמן קצר לאחר הבקיעה. רק טיפול מוגבל של אפרוחים נדרש. ארגז כלים נוחים זה של שיטות תואם לחלוטין עם RRR-ההנחיות.
Abstract
ניסויים רבים דורשים נחישות מוקדמת של המין של הצאצאים, כמו גם מוקדם סימון של יילודים לזיהוי פרט. על פי הנחיות לרווחת בעלי החיים, יש להעדיף טכניקות לא פולשנית בכל פעם שישימה. בקבוצה שלנו, אנחנו עובדים על מינים שונים של ציפורים שיר במעבדה ובשדה, ואנחנו מיישמים בהצלחה בשיטות שאינן פולשנית למין ובנפרד לסמן אפרוחים. מאמר זה מציג ארגז כלים לא פולשנית מקיף. זיהוי מין ציפורים לפני הביטוי של תכונות מיניות משניים דורש איסוף חומר DNA נושא עבור ה-PCR. הקמנו שיטה מהירה וקלה לציפורים ממין בכל גיל (לאחר בקיעה) על ידי מיצוי DNA ממטליות buccal. ניתן להשיג תוצאות בתוך 3 שעות. לנוצות במורד של חומוס סימון בודד הם גזומים בדפוסים מסוימים המאפשרים זיהוי מהיר בתוך סדר הבקיעה. זו קבוצה של שיטות היא ישימה בקלות במעבדה סטנדרטית מאובזרת ומתאים במיוחד לעובדg בתחום כללא ציוד מיוחד הנדרש לדגימה ואחסון. טיפול באפרוחים הוא ממוזער וטכניקות לסימון וזיהוי מין הן לא פולשנית וכך תומכות RRR-העיקרון של קווים מנחים לרווחת בעלי החיים.
Introduction
הכרת פרט, זיהוי מין באמצעים וגנוטיפ הם תנאים מוקדמים בסיסיים במגוון רחב של מחקרים ניסיוניים. השגת חומר נושאות דנ"א וסימון נושאים באופן חד משמעי (גם בגיל צעיר) צריכה להיות השפעה מינימאלית על פיזיולוגיה, התנהגות והישרדות. במידת האפשר, יש להימנע מפרוצדורות פולשניות על פי עיקרון RRR 1.
שיטות לא פולשנית אינן מועילות רק לבעלי החיים אלא גם עשויה לשפר את הנתונים המתקבלים כחיות מושפעות פחות מהטיפולים.
בציפורים, זיהוי מין באמצעי DNA יכולים להתבצע על מספר חומרים בר השגה הלא פולשני כגללים 2, נוצות 3,4 או מטליות buccal 3,5,9. ללא קשר למטליות buccal המצב וגיל של הנבדק הן שיטת בחירה של זיהוי מין באמצעי עופות, כי הם קלים לביצוע, רק לעתים נדירות מצליחות והטיפול הוא קצר.
עד כה, ה-DNA ממטליות buccalהופק גם עם ערכות זמינות מסחרי 3,6 או זמן רב פרוטוקולי מיצוי DNA סטנדרטיים 3,6-8. ערכות הן לא רק יקרות למדי, אבל בפרוטוקולים שלהם יכולים להטיל אתגרים לעבודת שטח. כמה פרטים פרוצדורליים, כגון ייבוש ודגירה של דגימות, אינם מעשיים בתחום. במיוחד בסביבה שבי פרוטוקולי ניסוי דורשים טיפול תלוי מין ממוקדם ככל שלאחר דקות ספורות בקיעה, יש דחף לשיטה מהירה, לא פולשנית, אמינה וקלה להשגת תוצאות.
מעבר למיני עופות ארגז כלים משמעותיים ליחידים לציון פותחו 10. המגוון הרחב של הטכניקות זמינות חשבונות עבור מגוון רחב של מטרות מחקר, מינים ותקציבים. עם זאת, סימון גוזלים קטנים התמודד חוקרים עם אתגרים נוספים. בכמה מיני אפרוחים (למשל passerines) הם קטנים מדי כדי להחיל להקות רגל ודורשים שיטות חלופיות, אשראינו משנה הורה לצאצאי התנהגות. כמודעות ועניין בשיפור רווחת בעלי חיים וטכניקות במחקרי שדה ומעבדה גדלה, השימוש בטכניקות לא פולשנית הוא מומלץ מאוד ועדיף.
פרוטוקול זה מספק שיטה לא פולשנית, מהירה, קל לזיהוי ומתמשכת לציון גוזלים צעירים מאוד אינדיבידואלי לפני יישום להקות רגל אינו ריאלי. שיטת סימון זו הציגה באחד מיני מודל מעבדת עופות החשובים ביותר, הזברה פינק (guttata Taeniopygia) 11-13. הפרוטוקול עומד בכל המטרות שפורסמו בעבר לטכניקות סימון בודד 10 וכבר הוחל 14,15 בהצלחה.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי מין ממטליות buccal באמצעות Chelex הראה שיעור הצלחה גבוה מאוד. הנוצות למטה של גוזל חיתוך אפשרו הבחנה בין גוזלים עד פסי רגל היו אפשריים.
חילוץ Chelex-DNA ממטליות buccal הניב מספיק DNA כדי לבצע זיהוי מין באמצעים מולקולריים בהצלחה. קביעת מי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה רבות לסלקו קיפר, שרה קיפר, מיכאל וייס, קוני Bartsch וסלק ויגט-Heucke לאוסף נלהב מדגם בתחום, לJanett ירקנפלד להמשך סיוע, לאולה Kobalz לג'לים היפה וטוביאס קראוזה לתמיכה מוראלית.
Materials
| Whatman 3MM Chromatography paper | e.g. Fisher Scientific | No.:3030-153 | |
| Chelex 100 Resin | Biorad | #143-2832 | |
| Taq polymerase | addgene | http://www.addgene.org/25712/ | |
| leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2,5 mm) | Horst Stengel & Sohn |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , (1959).
- Robertson, B. C., et al. Molecular sexing of individual kakapo, Strigops habroptilus Aves, from feces. Mol. Ecol. 8, 1349-1350 (1999).
- Yannic, G., et al. Description of microsatellite markers and genotyping performances using feathers and buccal swabs for the Ivory gull (Pagophila eburnea). Mol. Ecol. Resour. 11, 877-889 (2011).
- Bello, N., et al. Isolation of genomic DNA from feathers. J. Vet. Diagn. Invest. 13, 162-164 (2001).
- Handel, C. M., et al. Use of buccal swabs for sampling DNA from nestling and adult birds. Wildl. Soc. Bull. 34, 1094-1100 (2006).
- Brubaker, J. L., et al. A noninvasive, direct real-time PCR method for sex determination in multiple avian species. Mol. Ecol. Resour. 11, 415-417 (2011).
- Arima, H., Ohnishi, N. Usefulness of avian buccal cells for molecular sexing. Ornithological Science. 5, 139-143 (2006).
- Seki, S. -. I. Molecular sexing of individual Ryukyu Robins Erithacus komadori using buccal cells as a non-invasive source of DNA. Ornithological Science. 2, 135-137 (2003).
- Wellbrock, A. H. J., et al. Buccal swabs as a reliable source of DNA for sexing young and adult Common Swifts (Apus apus). J. Ornithol. 153, 991-994 (2012).
- Marion, W. R., Shamis, J. D. Annotated-Bibliography of Bird Marking Techniques. Bird Banding. 48, 42-61 (1977).
- Scharff, C., Adam, I. Neurogenetics of birdsong. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Griffith, S. C., Buchanan, K. L. The Zebra Finch: the ultimate Australian supermodel. Emu. 110, 5-12 (2010).
- Fee, M. S., Scharff, C. The songbird as a model for the generation and learning of complex sequential behaviors. Ilar J. 51, 362-377 (2010).
- Honarmand, M., et al. Stressful dieting: nutritional conditions but not compensatory growth elevate corticosterone levels in zebra finch nestlings and fledglings. PLoS On. 5, (1371).
- Krause, E. T., et al. Zebra finch nestlings beg more under better nutritional conditions. Behaviour. 148, 1239-1255 (2011).
- Griffiths, R., et al. A DNA test to sex most birds. Mol. Ecol. 7, 1071-1075 (1998).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21, 4850-4851 (1993).
- . Joint Working Group on Refinement. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 35, 1-163 (2001).
