Vem är vem? Icke-invasiva metoder för att individuellt Sex och Mark altricial Chicks
Summary
Protokollet ger en bekväm uppsättning metoder, som möjliggör extremt snabb, enkel, icke-invasiv, pålitlig och billig, molekylär könsbestämning av fåglar och deras icke-invasiv, snabb, säker och lätt att känna igen markering strax efter kläckning. Endast begränsad hantering av kycklingar krävs. Denna praktiska verktygslåda av metoder överensstämmer helt med de RRR-riktlinjerna.
Abstract
Många försök kräver tidig bestämning avkommor kön samt tidig markering av nyfödda för enskilda erkännande. Enligt riktlinjer för djurskydd, bör icke-invasiva metoder att föredra när det är tillämpligt. I vår grupp arbetar vi på olika arter av sångfåglar i labbet och på fältet, och vi lyckas tillämpa icke-invasiva metoder för att kön och individuellt markera kycklingar. Denna uppsats presenterar en omfattande icke-invasiv verktygslåda. Att könsbestämma fåglarna före uttrycket av sekundära sexuella egenskaper kräver insamling av DNA-lagermaterial för PCR. Vi etablerade en snabb och enkel metod för sex fåglar i alla åldrar (inlägget kläckning) genom att extrahera DNA från buckala kompresser. Resultat kan erhållas inom tre timmar. För individuell märkning chick s dunfjädrar trimmas i ett specifikt mönster som möjliggör snabb identifiering inom kläckning ordning. Denna uppsättning metoder är lätt tillämplig i en standard utrustat laboratorium och särskilt lämplig för working på området eftersom ingen speciell utrustning krävs för provtagning och lagring. Hantering av kycklingar minimeras och märkning och könsbestämning tekniker är icke-invasiv sätt stödja RRR-principen om riktlinjer för djurskydd.
Introduction
Individuell erkännande, könsbestämning och genotypning är grundläggande förutsättningar i olika experimentella studier. Skaffa DNA lagermaterial och märkning ämnen entydigt (även i tidig ålder) ska ha minimal inverkan på fysiologi, beteende och överlevnad. Om möjligt bör ingrepp undvikas enligt principen RRR 1.
Icke-invasiva metoder är inte bara fördelaktigt för djuret, utan också kan förbättra de erhållna data som djur påverkas mindre av behandlingarna.
Hos fåglar kan DNA könsbestämning utföras på ett antal icke-invasivt erhållbara material som spillning 2, fjädrar 3,4 eller buckala kompresser 3,5,9. Oberoende av patientens tillstånd och ålder buckala kompresser är den viktigaste metoden för aviär könsbestämning, eftersom de är lätta att utföra, sällan misslyckas och hantering är kort.
Hittills DNA från buckala kompresservar antingen extraheras med kommersiellt tillgängliga kit 3,6 eller tidskrävande standard DNA extraktion protokoll 3,6-8. Kit är inte bara ganska dyrt, men deras protokoll kan införa utmaningar för fältarbete. Vissa processuella detaljer, till exempel torkning och odling av prover, är inte praktiskt i fält. Särskilt i en miljö där experimentella protokoll kräver könsberoende behandling från så tidigt som några minuter efter kläckning, det finns suget efter en snabb, icke-invasiv, tillförlitlig och enkel metod för att få resultat.
Över aviär taxa betydande verktygslåda för märkning individer har utvecklats 10. Det breda utbud av tillgängliga tekniker står för olika forskningsmål, arter och budgetar. Men märkning små ungar har konfronterats forskare med ytterligare utmaningar. I vissa arter (t.ex. tättingar) kycklingar som är för små för att tillämpa benband och kräva att alternativa metoder som ärändrar inte förälder-avkomma beteende. Som medvetenhet och intresse av att förbättra djurens välbefinnande och tekniker i fält-och laboratoriestudier växer, är användningen av icke-invasiva tekniker uppmuntras och att föredra.
Protokollet ger en icke-invasiv, snabb, lätt att känna igen och ihållande metod att individuellt märka mycket unga ungar innan de ansöker benband är genomförbart. Denna märkningsmetod införs på en av de viktigaste fågellaboratoriemodellarter, Zebra Finch (Taeniopygia guttata) 11-13. Protokollet uppfyller alla de tidigare publicerade målen för enskilda märkningsteknik 10 och har redan med framgång tillämpats 14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att könsbestämma från buckala kompresser använder Chelex visade ett extremt bra resultat. Skärhatchling s dunfjädrar aktiverat differentiering mellan ungarna tills benet banding var möjligt.
Chelex-DNA-extraktion från buckala kompresser gav tillräckligt med DNA för att framgångsrikt utföra molekylär könsbestämning. Könsbestämning var 100% rätt som validerats av sexuellt dimorphic fjäderdräkt. Framgången rapporteras här är markant högre än den ränta som rapporteras a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stort tack till Silke Kipper, Sarah Kiefer, Michael Weiß, Conny Bartsch och Silke Voigt-Heucke för entusiastiska provtagning i fält, till Janett Birkenfeld för fortsatt bistånd till Ulla Kobalz för de vackra geler och Tobias Krause för moraliskt stöd.
Materials
| Whatman 3MM Chromatography paper | e.g. Fisher Scientific | No.:3030-153 | |
| Chelex 100 Resin | Biorad | #143-2832 | |
| Taq polymerase | addgene | http://www.addgene.org/25712/ | |
| leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2,5 mm) | Horst Stengel & Sohn |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , (1959).
- Robertson, B. C., et al. Molecular sexing of individual kakapo, Strigops habroptilus Aves, from feces. Mol. Ecol. 8, 1349-1350 (1999).
- Yannic, G., et al. Description of microsatellite markers and genotyping performances using feathers and buccal swabs for the Ivory gull (Pagophila eburnea). Mol. Ecol. Resour. 11, 877-889 (2011).
- Bello, N., et al. Isolation of genomic DNA from feathers. J. Vet. Diagn. Invest. 13, 162-164 (2001).
- Handel, C. M., et al. Use of buccal swabs for sampling DNA from nestling and adult birds. Wildl. Soc. Bull. 34, 1094-1100 (2006).
- Brubaker, J. L., et al. A noninvasive, direct real-time PCR method for sex determination in multiple avian species. Mol. Ecol. Resour. 11, 415-417 (2011).
- Arima, H., Ohnishi, N. Usefulness of avian buccal cells for molecular sexing. Ornithological Science. 5, 139-143 (2006).
- Seki, S. -. I. Molecular sexing of individual Ryukyu Robins Erithacus komadori using buccal cells as a non-invasive source of DNA. Ornithological Science. 2, 135-137 (2003).
- Wellbrock, A. H. J., et al. Buccal swabs as a reliable source of DNA for sexing young and adult Common Swifts (Apus apus). J. Ornithol. 153, 991-994 (2012).
- Marion, W. R., Shamis, J. D. Annotated-Bibliography of Bird Marking Techniques. Bird Banding. 48, 42-61 (1977).
- Scharff, C., Adam, I. Neurogenetics of birdsong. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Griffith, S. C., Buchanan, K. L. The Zebra Finch: the ultimate Australian supermodel. Emu. 110, 5-12 (2010).
- Fee, M. S., Scharff, C. The songbird as a model for the generation and learning of complex sequential behaviors. Ilar J. 51, 362-377 (2010).
- Honarmand, M., et al. Stressful dieting: nutritional conditions but not compensatory growth elevate corticosterone levels in zebra finch nestlings and fledglings. PLoS On. 5, (1371).
- Krause, E. T., et al. Zebra finch nestlings beg more under better nutritional conditions. Behaviour. 148, 1239-1255 (2011).
- Griffiths, R., et al. A DNA test to sex most birds. Mol. Ecol. 7, 1071-1075 (1998).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21, 4850-4851 (1993).
- . Joint Working Group on Refinement. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 35, 1-163 (2001).
