To metoder til fastsættelse primære humane Endometriecancer stromacellers fra Hysterektomi Prøver
Summary
Etablering primære endometriale stromacellelinier kultur systemer fra hysterektomi prøver er en værdifuld biologisk teknik og et afgørende skridt forud for at forfølge en bred vifte af forskning sigter. Her beskriver vi to metoder, der anvendes til at etablere stromale kulturer fra kirurgisk resektion endometrie væv af menneskelige patienter.
Abstract
Mange bestræbelser har været afsat til at etablere in vitro-cellekultur-systemer. Disse systemer er designet til at modellere et utal af in vivo processer. Cellekultursystemer opstår fra humane endometriske prøver er ingen undtagelse. Applikationer spænder fra normale cykliske fysiologiske processer til endometrie patologier såsom gynækologisk cancer, infektionssygdomme og nedsat fertilitet. Her giver vi to metoder til oprettelse primære endometrie stromaceller fra kirurgisk resektion endometrie hysterektomi prøver. Den første metode er benævnt "skrabe"-metoden og omfatter mekanisk skrabning ved hjælp af kirurgisk eller barberblade, mens den anden metode betegnes "trypsin-metoden". Sidstnævnte metode anvender den enzymatiske aktivitet af trypsin til at fremme adskillelse af celler og primære celleudgroning. Vi illustrerer trin-for-trin metode gennem digitale billeder og mikroskopi. Vi har også provide eksempler på validering endometriale stromacellelinier via kvantitative realtids polymerasekædereaktioner (qPCR) og immunfluorescens (IF).
Introduction
Den humane uterus korpus består af tre lag, det perimetrium (eller serosa), myometrium og endometriet. At skelne hver af disse lag er et vigtigt skridt til at etablere endometriale cellelinjer. Den perimetrium er den yderste lag af livmoderen og består af tynde, serøse celler. Myometrium er tyk, midterste lag af livmoderen og består af glatte muskelceller. Endometriet er identificeret som det indre lag af livmoderen og omfatter epitel og stroma cellepopulationer.
Endometrium er yderligere opdeles i basalis lag, hvis stamceller befolkning er en hypotese at genbesætte functionalis lag ca hver 28 dage 1. Det functionalis lag af den menneskelige endometrium undergår betydelige biokemiske og morfologiske ændringer som reaktion på cirkulerende hormoner. Disse hormoner er afledt fra hypofysen og æggestokkene.
Denkoordineret produktion og frigivelse af hormoner resulterer i et reproduktive cyklus. Den reproduktive cyklus er designet til at forberede endometriet for potentielle embryo implantation begivenheder. Hos mennesker er den reproduktive cyklus kendt som "Menstruation", og opdelt i tre faser – proliferativ, sekretoriske og menstruation. Den proliferative fase omfatter udbredelsen af functionalis endometrie lag hvorimod den sekretoriske fase er præget af functionalis modning. Specifikt ekstracellulære forandringer, sekreter og cellulær differentiering signalere en potentiel implantation. Hvis implantation ikke sker inden udløbet af den sekretoriske fase bliver functionalis endometriske lag kaste under menstruation fase. Betydningen af menstruation og de begivenheder, der udløser udgydelse af functionalis lag bliver stadig debatteret. Hos mennesker er det blevet foreslået, at menstruation er resultatet af en specifik mid-sekretorisk fase differentiering begivenhed er kendtsom "spontan decidualization" 2. I dette manuskript, giver vi detaljeret metode til både endometrie stromacelle isolation metoder, og bruge en kombination af immunfluorescens og digitale billeder for at vise effekten af disse tilgange. Derudover anvender vi et almindeligt anvendt in vitro-model af spontan decidualization at bekræfte endometrial stromacelle isolation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Andre grupper har beskrevet og tilpasset metode for udarbejdelse af endometrie stroma kulturer, hvoraf de fleste anvender collagenase 4,12,13,15-18. I dette manuskript, har vi givet metode og evidens for to forenklede primære endometrie stroma dyrkningsmetoder, som begge er brugt af vores laboratorium af økonomiske årsager og praktisk tilgængelighed af trypsin og / eller et barberblad.
Når man sammenligner vores to metoder, begge med succes genererer levedygtige primære kult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker fælles indsats Dr. Thao Dang og medlemmer af hendes laboratorium for brug af deres billeder og mikroskop-udstyr. Vi takker også Biorepository og Tissue Research Facility (BTRF) kerne, Jeff Harper, og beboerne på University of Virginia til at forsyne os med uterin væv. Vi takker Karol Szlachta for hjælpen med skematisk oversigt.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
References
- Heller, D., Heller, D. . in The endometrium: a clinicopathologic approach. , 56-75 (1994).
- Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
- Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
- Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
- Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
- Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
- Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
- Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
- Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
- Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
- Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
- Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
- Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
- Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
- Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
- Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
- . . American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , (2013).
- Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).
