자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법
Summary
자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포 배양 시스템을 구축하는 것은 이전의 연구 목표의 광대 한 배열을 추구하는 귀중한 생물 기술과 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 인간의 환자의 수술 적 절제술 자궁 내막 조직에서 기질 문화를 설정하는 데 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다.
Abstract
많은 노력이 체외 세포 배양 시스템의 구축에 전념하고 있습니다. 이러한 시스템은 생체 내 프로세스의 광대 한 번호를 모델로 설계되어 있습니다. 인간의 자궁 내막 샘플에서 발생하는 세포 배양 시스템도 예외는 아니다. 응용 프로그램은 정상적인 생리주기 프로세스에서 같은 부인과 암, 감염성 질환, 생식 결함으로 자궁 내막 병변의 범위. 여기, 우리는 수술 절제 자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포를 확립하기위한 두 가지 방법을 제공합니다. 첫 번째 방법은 "스크래핑 방법"이라하고 두 번째 방법은 칭했다 반면 수술 또는 면도날을 사용하여 기계적 스크래핑 통합되는 "트립신 방법."이 후자의 방법은 세포의 분리 및 일차 홍보 트립신 효소 활성을 사용 세포 가지. 우리는 디지털 이미지와 현미경을 통해 단계별 방법을 설명한다. 우리는 또한 제공하기양적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 및 면역 (IF)를 통해 자궁 내막 기질 세포 라인의 유효성을 검사하는 전자의 예입니다.
Introduction
인간의 자궁 체부는 세 개의 층, perimetrium (또는 장막), 자궁 근층 및 자궁 내막으로 구성되어 있습니다. 이들 층의 각각을 구별하는 것은 내막 세포주를 확립하는 중요한 단계이다. perimetrium은 자궁의 가장 바깥 층과 얇은 장액 세포로 구성. 근육층은 두꺼운 중간 자궁의 층과 평활근 세포로 구성된다. 자궁 내막은 자궁의 내부 층으로 식별하고 상피 및 간질 세포 집단을 포함한다.
자궁 내막은 또한 그 줄기 세포 인구는 약 28 일마다 1 functionalis 층을 다시 채울 가설 basalis 층으로 구분된다. 인간의 자궁 내막의 functionalis 층 호르몬 순환에 대한 응답으로 중요한 생화학 적 및 형태 학적 변화를 겪는다. 이 호르몬은 뇌하수체와 난소에서 파생됩니다.
생식주기의 조정 생산 및 호르몬 결과의 릴리스. 생식주기는 잠재적 인 배아 주입 이벤트에 대한 내막을 준비하도록 설계되었습니다. 인간의 생식주기는 "월경주기"라고하며 다음과 같은 세 가지 단계로 구분 – 증식, 분비, 월경. 분비 단계가 functionalis 성숙에 의해 표시되는 반면 증식 단계는 functionalis 자궁 내막 층의 확산을 포함한다. 특히, 세포 변화, 분비물, 그리고 세포 분화는 잠재적 인 주입 신호. 주입이 분비 단계의 끝 이전에 발생하지 않는 경우, functionalis의 자궁 내막 층은 생리 단계 흘렸다. 생리 및 functionalis 층의 흘리기를 트리거하는 이벤트의 중요성은 여전히 논의되고있다. 인간에서는, 생리 알려진 특정 미드 분비 기 감별 이벤트의 결과라고 제기되었다"자연 탈락"2 등. 이 논문에서는, 양쪽 자궁 내막 세포 분리 방법에 대한 상세한 방법을 제공하며, 이러한 방법의 효능을 입증하기 위하여 면역 형광 및 디지털 이미지의 조합을 사용한다. 또, 일반적으로 적용 자궁 내막 세포 격리을 확인하기 위하여 자발 탈락의 시험 관내 모델에서 사용.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 그룹은 콜라게나 4,12,13,15-18를 활용 대부분의 자궁 내막 기질 문화의 제조 방법을 설명하고 적응. 이 논문에서, 우리는 경제적 인 이유와 트립신 및 / 또는 면도날의 편리한 이용 가능 여부 연구실로 활용 둘 중 두 가지 간단한 기본 자궁 내막 배양 방법에 대한 방법론과 증거를 제공했다.
우리의 두 가지 방법을 비교했을 때, 모두가 성공적으로 실행 가능한 차 문…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 이미징 및 현미경 장비의 사용을 위해 박사 타오 댕와 그녀의 실험실의 구성원의 공동 노력을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 자궁 조직으로 우리를 제공하기위한 Biorepository 및 조직 연구 시설 (BTRF) 코어, 제프 하퍼, 버지니아 대학에서 주민 감사합니다. 우리는 도식 개요와 도움 카롤 Szlachta 감사합니다.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
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