Due metodi per stabilire primarie cellule umane endometriale stromali da isterectomia campioni
Summary
Stabilire sistemi di coltura primarie endometriali stromali di cellule da campioni di isterectomia è una tecnica biologica prezioso e un passo fondamentale prima di perseguire una vasta gamma di ricerca mira. Qui, descriviamo due metodi utilizzati per stabilire culture stromali da tessuto endometriale chirurgicamente resecati di pazienti umani.
Abstract
Molti sforzi sono stati dedicati ad elaborare sistemi di colture cellulari in vitro. Questi sistemi sono progettati per modellare un vasto numero di processi in vivo. Sistemi di colture cellulari derivanti da campioni endometriali umane non fanno eccezione. Le applicazioni spaziano dai normali processi fisiologici ciclici a patologie endometriali come i tumori ginecologici, malattie infettive, e carenze riproduttive. Qui, mettiamo a disposizione due metodi per stabilire cellule stromali endometriali primarie da campioni di isterectomia endometriale chirurgicamente asportati. Il primo metodo è indicato come "metodo raschiatura" e incorpora raschiatura meccanica usando lame chirurgiche o rasoio mentre il secondo metodo è chiamato "il metodo tripsina." Quest'ultimo metodo utilizza l'attività enzimatica di tripsina per promuovere la separazione di cellule e primaria escrescenza cellulare. Illustriamo metodologia step-by-step per immagini digitali e microscopia. Abbiamo anche provide gli esempi per convalidare le linee di cellule stromali endometriali mediante reazioni quantitative in tempo reale catena della polimerasi (qPCR) e di immunofluorescenza (IF).
Introduction
Il corpus utero umano è costituito da tre strati, il perimetrium (o sierosa), miometrio, e l'endometrio. Distinguere ciascuno di questi livelli è un passo importante per stabilire linee di cellule endometriali. Il perimetrium è strato più esterno dell'utero e composto, cellule sierose sottili. Il miometrio è la spessa, strato intermedio dell'utero e composta da cellule muscolari lisce. L'endometrio è identificato come strato interno dell'utero e comprende popolazioni epiteliali e cellule stromali.
L'endometrio è ulteriormente suddivisa in strato basale il cui stelo popolazione cellulare è ipotizzato di ripopolare il livello functionalis circa ogni 28 giorni 1. Lo strato functionalis dell'endometrio umano subisce significative variazioni biochimiche e morfologiche in risposta agli ormoni circolanti. Questi ormoni sono derivati dalla ghiandola pituitaria e le ovaie.
Ilproduzione coordinata e il rilascio di ormoni risultati in un ciclo riproduttivo. Il ciclo riproduttivo è progettato per preparare l'endometrio per potenziali eventi impianto dell'embrione. Negli esseri umani, il ciclo riproduttivo è conosciuto come "il ciclo mestruale" e suddiviso in tre fasi – proliferativa, secretori, e mestruali. La fase proliferativa comporta la proliferazione del functionalis livello endometriale mentre la fase secretoria è segnato da functionalis maturazione. In particolare, alterazioni extracellulari, secrezioni e differenziazione cellulare segnalano un potenziale impianto. Se l'impianto non si verifica prima della fine della fase secretoria, lo strato functionalis endometriale è sparso durante la fase mestruale. L'importanza delle mestruazioni e gli eventi che attivano lo spargimento dello strato functionalis sono ancora in discussione. Negli esseri umani, è stato posto che le mestruazioni è il risultato di un evento specifico metà secretoria differenziazione fase conosciutacome "decidualizzazione spontanea" 2. In questo manoscritto, forniamo metodologia dettagliata per entrambi i metodi di isolamento delle cellule stromali dell'endometrio, e usiamo una combinazione di immunofluorescenza e immagini digitali per dimostrare l'efficacia di questi approcci. Inoltre, si applica una comunemente usato modello in vitro di decidualizzazione spontaneo per confermare endometriale isolamento delle cellule stromali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Altri gruppi hanno descritto e adattato metodologia per la preparazione di colture stromali endometriali, molti dei quali utilizzano collagenasi 4,12,13,15-18. In questo manoscritto, abbiamo fornito metodologia e prove per due metodi di coltura stromale semplificate primarie endometriali, entrambi i quali sono utilizzati dal nostro laboratorio per motivi economici e conveniente disponibilità di tripsina e / o una lama di rasoio.
Quando si confrontano i nostri due metodi, entrambi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo gli sforzi di collaborazione del Dr. Thao Dang ed i membri del suo laboratorio per l'uso delle loro apparecchiature di imaging e microscopio. Ringraziamo anche il Biorepository e Tissue Research Facility (BTRF) nucleo, Jeff Harper, ei residenti presso l'Università della Virginia per averci fornito con il tessuto uterino. Ringraziamo Karol Szlachta per l'aiuto con schematica panoramica.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
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