Deux méthodes de fixation des cellules humaines de l'endomètre stromales primaires de spécimens hystérectomie
Summary
Établir des systèmes primaires de l'endomètre stromales de cellules de culture à partir d'échantillons hystérectomie est une technique biologique précieux et une étape cruciale avant de poursuivre une vaste gamme de recherche vise. Ici, nous décrivons deux méthodes utilisées pour établir les cultures stromales de tissus de l'endomètre résection chirurgicale des patients humains.
Abstract
Beaucoup d'efforts ont été consacrés à établir des systèmes de culture cellulaire in vitro. Ces systèmes sont conçus pour modéliser un grand nombre de procédés in vivo. systèmes de culture cellulaire résultant de l'endomètre échantillons humains ne font pas exception. Les applications vont de processus physiologiques cycliques normales à des pathologies de l'endomètre telles que les cancers gynécologiques, les maladies infectieuses et les carences en matière de reproduction. Ici, nous proposons deux méthodes pour établir des cellules stromales de l'endomètre primaires à partir d'échantillons d'hystérectomie endomètre résection chirurgicale. Le premier procédé est appelé «le procédé de raclage" et intègre raclage mécanique à l'aide des lames chirurgicales ou rasoir tandis que le second procédé est appelé «le procédé de la trypsine." Cette dernière méthode utilise l'activité enzymatique de la trypsine, de promouvoir la séparation des cellules et primaire excroissance cellulaire. Nous illustrons la méthodologie étape par étape à travers des images numériques et la microscopie. Nous également providexemples de e pour la validation des lignées de cellules stromales de l'endomètre par des réactions quantitatives en temps réel de la chaîne de la polymérase (qPCR) et immunofluorescence (IF).
Introduction
Le corpus de l'utérus humain est composé de trois couches, la perimetrium (ou séreuse), le myomètre et l'endomètre. Distinguer chacune de ces couches est une étape importante pour établir des lignées cellulaires de l'endomètre. Le perimetrium est la couche la plus externe de l'utérus et composée de fines cellules séreuses. Le myomètre est la couche intermédiaire épaisse de l'utérus et le composé de cellules musculaires lisses. L'endomètre est identifié en tant que couche intérieure de l'utérus et comprend des populations de cellules épithéliales et stromales.
L'endomètre est encore subdivisé en couche basalis dont la tige population cellulaire est l'hypothèse de repeupler la couche de functionalis environ tous les 28 jours 1. La couche de functionalis de l'endomètre humain subit des modifications biochimiques et morphologiques importantes en réponse aux hormones circulant. Ces hormones sont dérivées de la glande pituitaire et les ovaires.
Laproduction coordonnée et la libération d'hormones entraîne un cycle de reproduction. Le cycle de reproduction est conçu pour préparer l'endomètre pour les événements potentiels d'implantation embryonnaire. Chez les humains, le cycle de reproduction est connu comme "le cycle menstruel" et divisé en trois phases – proliférative, sécrétoires, et menstruels. La phase proliférative implique la prolifération de l'endomètre functionalis couche tandis que la phase sécrétoire est marquée par functionalis maturation. Plus précisément, les modifications extracellulaires, les sécrétions, et la différenciation cellulaire signalent une implantation potentielle. Si l'implantation ne se produit pas avant la fin de la phase de sécrétion, la couche functionalis de l'endomètre est éliminée au cours de la phase menstruel. L'importance de la menstruation et les événements qui déclenchent l'effusion de la couche de functionalis sont encore en discussion. Chez l'homme, il a été posé que la menstruation est le résultat d'un événement à mi-sécrétoire différenciation de phase spécifique connuecomme "décidualisation spontanée» 2. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthodologie détaillée pour les deux méthodes d'isolement de cellules stromales de l'endomètre, et utilisons une combinaison de l'immunofluorescence et des images numériques pour démontrer l'efficacité de ces approches. En outre, nous appliquons un modèle couramment utilisé dans vitro de décidualisation spontanée pour confirmer l'isolement de cellules stromales de l'endomètre.
Protocol
Representative Results
Discussion
D'autres groupes ont décrit et adapté méthodologie pour la préparation de cultures stromales endométriales, dont la plupart utilisent la collagénase 4,12,13,15-18. Dans ce manuscrit, nous avons fourni la méthodologie et les données pour deux endomètre méthodes de culture de cellules stromales primaires simplifiées, qui sont tous deux utilisés par notre laboratoire pour des raisons économiques et de la disponibilité pratique de la trypsine et / ou une lame de rasoir.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la collaboration de Dr Thao Dang et les membres de son laboratoire pour l'utilisation de leur équipement d'imagerie et d'un microscope. Nous remercions également la banque de tissus biologiques et de tissus installation de recherche (BTRF) noyau, Jeff Harper, et les résidents de l'Université de Virginie de nous fournir le tissu utérin. Nous remercions Karol Szlachta pour l'aide avec vue d'ensemble schématique.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
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