Dos métodos para fijar las células humanas primarias endometrial estromales de la histerectomía especímenes
Summary
El establecimiento de los sistemas primarios de células endometriales estromales de cultivo a partir de especímenes de histerectomía es una técnica biológica valiosa y un paso crucial antes de continuar con una amplia gama de objetivos de investigación. Aquí se describen dos métodos utilizados para establecer cultivos de estroma de los tejidos del endometrio resecado quirúrgicamente de pacientes humanos.
Abstract
Muchos esfuerzos se han dedicado a establecer en sistemas de cultivo celular in vitro. Estos sistemas están diseñados para modelar un gran número de procesos in vivo. Sistemas de cultivos celulares derivados de muestras endometriales humanas no son una excepción. Las aplicaciones varían desde procesos fisiológicos normales cíclicos a patologías endometriales, tales como los cánceres ginecológicos, enfermedades infecciosas, y fallos del aparato reproductor. Aquí, le ofrecemos dos métodos para establecer células estromales endometriales primarios a partir de especímenes de histerectomía endometrio resecado quirúrgicamente. El primer método se conoce como "el método de raspado" e incorpora raspado mecánico utilizando cuchillas quirúrgicas o de afeitar mientras que el segundo método se denomina "el método de tripsina." Este último método utiliza la actividad enzimática de tripsina para promover la separación de células y primaria excrecencia celular. Nos ilustran la metodología paso a paso a través de imágenes digitales y la microscopía. También provide ejemplos de validación de líneas celulares del estroma endometrial por medio de reacciones cuantitativas en tiempo real de la cadena de la polimerasa (qPCR) e inmunofluorescencia (IF).
Introduction
El corpus útero humano se compone de tres capas, la perimetrio (o serosa), el miometrio, y el endometrio. Distinguir cada una de estas capas es un paso importante para establecer líneas celulares del endometrio. El perimetrio es la capa más externa del útero y compone de células delgadas y serosas. El miometrio es la capa gruesa, medio del útero y compuesta de células del músculo liso. El endometrio se identifica como la capa interior del útero e incluye células epiteliales y estromales poblaciones.
El endometrio se subdivide a su vez en la capa basal cuyo tallo población celular es la hipótesis de la repoblación de la capa functionalis aproximadamente cada 28 días 1. La capa functionalis del endometrio humano sufre cambios bioquímicos y morfológicos significativas en la respuesta a las hormonas circulantes. Estas hormonas se derivan de la glándula pituitaria y los ovarios.
Lacoordinó la producción y liberación de hormonas resulta en un ciclo reproductivo. El ciclo reproductivo está diseñado para preparar el endometrio para eventos potenciales de implantación del embrión. En los humanos, el ciclo reproductivo se conoce como "ciclo menstrual" y se divide en tres fases – proliferativa, secretora y menstrual. La fase proliferativa implica la proliferación de la capa de endometrio functionalis mientras que la fase secretora se caracteriza por functionalis maduración. En concreto, las alteraciones extracelulares, secreciones y la diferenciación celular señalan un potencial de implantación. Si la implantación no se produce antes de que el final de la fase secretora, la capa de endometrio functionalis se desprende durante la fase menstrual. La importancia de la menstruación y los acontecimientos que desencadenan el desprendimiento de la capa functionalis todavía se está debatiendo. En los seres humanos, se ha planteado que la menstruación es el resultado de un evento específico mediados de secretora diferenciación fase conocidacomo "decidualization espontánea" 2. En este manuscrito, proporcionamos metodología detallada para ambos métodos de aislamiento de células estromales endometriales, y utilizamos una combinación de inmunofluorescencia e imágenes digitales para demostrar la eficacia de estos enfoques. Además, se aplica una de uso común en modelo in vitro de decidualización espontánea para confirmar el aislamiento de células del estroma endometrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Otros grupos han descrito y adaptado metodología para la preparación de cultivos estromales endometriales, la mayoría de los cuales utilizan colagenasa 4,12,13,15-18. En este manuscrito, hemos proporcionado la metodología y la evidencia de dos métodos de cultivo estromal simplificados primarias endometrial, los cuales son utilizados por nuestro laboratorio por razones económicas y de la disponibilidad adecuada de tripsina y / o una hoja de afeitar.
Al comparar nuestros dos m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a los esfuerzos de colaboración de Dr. Thao Dang y los miembros de su laboratorio para el uso de su equipo de imagen y el microscopio. También agradecemos al biorepositorio y Tejidos del centro de investigación (BTRF) núcleo, Jeff Harper, y los residentes de la Universidad de Virginia para que nos proporciona el tejido uterino. Damos las gracias a Karol Szlachta por la ayuda con Esquema general.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
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