Twee methoden voor het vaststellen van primaire humane Endometriale Stromal Cellen uit hysterectomie Exemplaren
Summary
Oprichting primaire endometrium stromale celkweek systemen van hysterectomie exemplaren is een waardevolle biologische techniek en een cruciale stap voorafgaand aan het nastreven van een breed scala van onderzoek wil. We beschrijven hier twee methoden om stroma culturen chirurgisch weggesneden endometriale weefsel van menselijke patiënten vastgesteld.
Abstract
Vele inspanningen gedaan om te bepalen in vitro celkweek systemen. Deze systemen zijn ontworpen om een model van een groot aantal in vivo processen. Celkweek systemen die voortkomen uit menselijke endometrium monsters zijn geen uitzondering. Toepassingen variëren van normale cyclische fysiologische processen endometrium pathologieën zoals gynaecologische kankers, infectieziekten en voortplantingsfunctie. Hier bieden we twee methoden voor het vaststellen van primaire endometrium stromale cellen van chirurgisch weggesneden endometrium hysterectomie exemplaren. De eerste methode wordt aangeduid als "het schrapen methode" en omvat mechanische schrapen met chirurgische of scheermesjes, terwijl de tweede methode wordt aangeduid als "de trypsine-methode. 'Deze laatste methode wordt de enzymatische activiteit van trypsine om de scheiding van de elementen en bevorderen cel uitgroei. We illustreren stap-voor-stap methode door middel van digitale beelden en microscopie. We hebben ook provide voorbeelden voor het valideren van endometrium stromale cellijnen via kwantitatieve real time polymerase kettingreactie (qPCR) en immunofluorescentie (IF).
Introduction
De menselijke baarmoeder corpus bestaat uit drie lagen, de perimetrium (of serosa), het myometrium en het endometrium. Onderscheidende elk van deze lagen een belangrijke stap endometrium cellijnen vast. De perimetrium is de buitenste laag van de baarmoeder en samengesteld uit dunne, sereuze cellen. De myometrium is de dikke, middelste laag van de baarmoeder en bestaat uit gladde spiercellen. Het endometrium is geïdentificeerd als de binnenste laag van de baarmoeder en omvat epitheliale en stromale cel populaties.
Het endometrium is verder onderverdeeld in de basalis laag waarvan stamcelpopulatie wordt verondersteld dat de functionalis laag herbevolking ongeveer elke 28 dagen 1. De functionalis laag van het menselijke endometrium ondergaat significante biochemische en morfologische veranderingen in respons op circulerende hormonen. Deze hormonen zijn afgeleid van de hypofyse en de eierstokken.
Degecoördineerde productie en afgifte van hormonen resulteert in een voortplantingscyclus. De voortplantingscyclus is ontworpen om het endometrium te bereiden op mogelijke embryo implantatie gebeurtenissen. Bij mensen wordt de voortplantingscyclus bekend als "de menstruele cyclus" en onderverdeeld in drie fasen – proliferatieve, secretoire en menstruatie. De proliferatieve fase betreft de verspreiding van de functionalis endometrium laag terwijl de secretoire fase wordt gekenmerkt door functionalis rijping. Specifiek extracellulaire veranderingen, afscheidingen en celdifferentiatie signaal een mogelijke inplanting. Als implantatie niet geschieden vóór het einde van de secretoire fase wordt de functionalis baarmoederslijmvlies laag vergoten tijdens de menstruele fase. Het belang van de menstruatie en de gebeurtenissen die het vergieten van de functionalis laag triggeren zijn nog gedebatteerd. In mensen, is gesteld dat de menstruatie is het gevolg van een specifieke mid-secretoire fase differentiatie gebeurtenis bekendals "spontane decidualization" 2. In dit manuscript hebben we gedetailleerde methodologie voor zowel endometrium stromale celisolatie methoden, en gebruik een combinatie van immunofluorescentie en digitale beelden naar de werkzaamheid van deze benaderingen te tonen. Daarnaast we een algemeen in vitro model van spontane decidualization endometrium stromale cel isolatie bevestigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Andere groepen hebben beschreven en aangepaste methodologie voor de bereiding van endometriale stromale culturen, waarvan de meeste gebruik collagenase 4,12,13,15-18. In dit manuscript hebben we methodologie en bewijsmateriaal voor twee vereenvoudigde primaire endometriale stromale kweekmethoden, die beide worden gebruikt door ons laboratorium om economische redenen en de gemakkelijke verkrijgbaarheid van trypsine en / of een scheermesje.
Wanneer onze twee methoden vergelijken, zo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de gezamenlijke inspanningen van dr. Thao Dang en de leden van haar lab voor het gebruik van hun beeldvorming en microscoop apparatuur. We danken ook de biorepository en Tissue Research Facility (BTRF) kern, Jeff Harper, en de bewoners aan de Universiteit van Virginia voor het verstrekken van ons met baarmoeder weefsel. Wij danken Karol Szlachta voor de hulp met schematisch overzicht.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
References
- Heller, D., Heller, D. . in The endometrium: a clinicopathologic approach. , 56-75 (1994).
- Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
- Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
- Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
- Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
- Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
- Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
- Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
- Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
- Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
- Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
- Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
- Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
- Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
- Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
- Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
- . . American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , (2013).
- Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).
