गर्भाशय के नमूनों से प्राथमिक मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं की स्थापना के लिए दो तरीके
Summary
गर्भाशय नमूनों से प्राथमिक एंडोमेट्रियल stromal सेल संस्कृति प्रणालियों की स्थापना से पहले अनुसंधान करना है की एक विशाल सरणी का पीछा करने के लिए एक मूल्यवान जैविक तकनीक और एक महत्वपूर्ण कदम है. यहाँ, हम मानव रोगियों की शल्य चिकित्सा resected एंडोमेट्रियल ऊतकों से stromal संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रयोग किया जाता दो विधियों का वर्णन.
Abstract
कई प्रयासों के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति सिस्टम में स्थापित करने के लिए समर्पित किया गया है. इन पद्धतियों में विवो प्रक्रियाओं की एक बड़ी संख्या के लिए मॉडल तैयार कर रहे हैं. मानव एंडोमेट्रियल नमूने से उत्पन्न होने वाली सेल संस्कृति सिस्टम कोई अपवाद नहीं हैं. अनुप्रयोग सामान्य चक्रीय शारीरिक प्रक्रियाओं से ऐसे स्त्रीरोगों कैंसर, संक्रामक रोगों, और प्रजनन की कमी के रूप में एंडोमेट्रियल विकृतियों को लेकर. यहाँ, हम शल्य चिकित्सा resected एंडोमेट्रियल गर्भाशय नमूनों से प्राथमिक एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं की स्थापना के लिए दो तरीके प्रदान. पहली विधि "scraping विधि" के रूप में जाना जाता है और दूसरा तरीका करार दिया है जबकि शल्य चिकित्सा या रेज़र ब्लेड का उपयोग मैकेनिकल scraping शामिल है "trypsin विधि." यह बाद विधि कोशिकाओं की जुदाई और प्राथमिक बढ़ावा देने के लिए trypsin के enzymatic गतिविधि का उपयोग करता है सेल परिणाम. हम डिजिटल छवियों और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कदम दर कदम कार्यप्रणाली को दर्शाता है. हम यह भी प्रदानमात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं (qPCR) और immunofluorescence (यदि) के माध्यम से एंडोमेट्रियल stromal सेल लाइनों मान्य करने के लिए ई उदाहरण.
Introduction
मानव गर्भाशय कोष तीन परतों, perimetrium (या serosa), myometrium, और अंतर्गर्भाशयकला के शामिल है. इन परतों में से प्रत्येक भेद एंडोमेट्रियल सेल लाइनों की स्थापना के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. perimetrium गर्भाशय की सबसे बाहरी परत है और पतली, तरल कोशिकाओं से बना. myometrium मोटी, मध्य गर्भाशय की परत और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से मिलकर बना है. अंतर्गर्भाशयकला गर्भाशय की भीतरी परत के रूप में पहचान की है और उपकला और stromal सेल आबादी शामिल है.
अंतर्गर्भाशयकला आगे जिसका स्टेम सेल की आबादी लगभग हर 28 दिन 1 functionalis परत फिर से आबाद करने के लिए धारणा है बैसालिस परत में विभाजित है. मानव अंतर्गर्भाशयकला की functionalis परत हार्मोन परिसंचारी के जवाब में महत्वपूर्ण जैव रासायनिक और morphological परिवर्तन आए. ये हार्मोन पिट्यूटरी ग्रंथि और अंडाशय से निकाली गई है.
एक प्रजनन चक्र में समन्वित उत्पादन और हार्मोन के परिणाम की रिहाई. प्रजनन चक्र संभावित भ्रूण आरोपण घटनाओं के लिए अंतर्गर्भाशयकला तैयार बनाया गया है. मनुष्यों में प्रजनन चक्र "मासिक धर्म चक्र" के रूप में जाना जाता है और तीन चरणों में बांटा गया – proliferative, स्रावी, और मासिक धर्म. स्रावी चरण functionalis परिपक्वता द्वारा चिह्नित किया गया है, जबकि proliferative चरण functionalis एंडोमेट्रियल परत के प्रसार शामिल है. विशेष रूप से, बाह्य परिवर्तन, स्राव, और सेलुलर भेदभाव एक संभावित आरोपण संकेत. आरोपण स्रावी चरण के अंत से पहले नहीं होती है, functionalis एंडोमेट्रियल परत मासिक धर्म चरण के दौरान बहाया है. मासिक धर्म और functionalis परत का बहा कि ट्रिगर घटनाओं के महत्व को अभी भी बहस किया जा रहा है. मनुष्यों में यह मासिक धर्म में जाना एक विशिष्ट मध्य स्रावी चरण भेदभाव घटना का परिणाम है कि समक्ष रखी किया गया है"सहज decidualization" के रूप में 2. इस पांडुलिपि में, हम दोनों एंडोमेट्रियल stromal सेल अलगाव तरीकों के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करते हैं, और इन तरीकों की प्रभावकारिता प्रदर्शित immunofluorescence और डिजिटल छवियों का एक संयोजन का उपयोग करें. इसके अलावा, हम लागू सामान्यतः एंडोमेट्रियल stromal सेल अलगाव की पुष्टि के लिए सहज decidualization की इन विट्रो मॉडल में इस्तेमाल एक.
Protocol
Representative Results
Discussion
अन्य समूहों collagenase 4,12,13,15-18 उपयोग जिनमें से अधिकांश एंडोमेट्रियल स्ट्रोमल संस्कृतियों की तैयारी के लिए कार्यप्रणाली का वर्णन किया और ढाल लिया है. इस पांडुलिपि में, हम किफायती कारणों और trypsin और / या एक रेज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके इमेजिंग और माइक्रोस्कोप उपकरणों के उपयोग के लिए डॉ. Thao डांग और उसे प्रयोगशाला के सदस्यों के सामूहिक प्रयास धन्यवाद. हम यह भी गर्भाशय ऊतक के साथ हमें प्रदान करने के लिए biorepository और ऊतक अनुसंधान सुविधा (BTRF) कोर, जेफ हार्पर, और वर्जीनिया विश्वविद्यालय में निवासियों को धन्यवाद. हम योजनाबद्ध सिंहावलोकन के साथ मदद के लिए करोल Szlachta धन्यवाद.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
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