To metoder for å etablere primær Menneskelig Livmor stromale celler fra Hysterektomi Prøver
Summary
Etablering av primær endometrial stromal cellekultursystemer fra hysterektomi prøver er et verdifullt biologisk teknikk og et avgjørende skritt før forfølge en lang rekke forsknings mål. Her beskriver vi to metoder som brukes for å etablere stromal kulturer fra kirurgisk resekterte endometrial vev av menneskelige pasienter.
Abstract
Mange forsøk har vært viet til å etablere in vitro cellekultursystemer. Disse systemene er designet for å modellere et stort antall in vivo prosesser. Cellekultursystemer som følge av menneskelige endometrial prøvene er ikke noe unntak. Applikasjoner varierer fra normale cykliske fysiologiske prosesser i endometriale patologier slik som gynekologisk kreft, infeksjonssykdommer, og forplantnings mangler. Her gir vi to metoder for å etablere primær endometrial stromale celler fra kirurgisk resekterte endometrial hysterektomi prøver. Den første metode er referert til som "skrape-metoden", og innbefatter mekanisk skraping ved bruk av kirurgisk eller barberblader, mens den andre metoden er betegnet "den trypsin-metoden". Denne sistnevnte metode anvender den enzymatiske aktiviteten av trypsin for å fremme separasjon av celler og primære celleutvekst. Vi illustrere trinn-for-trinn metode gjennom digitale bilder og mikroskopi. Vi også kundenee eksempler for å validere endometrial stromal cellelinjer via kvantitative sanntid polymerase kjedereaksjoner (qPCR) og immunfluorescens (IF).
Introduction
Den menneskelige uterus korpus består av tre lag, det perimetrium (eller serosa), myometrium, og endometrium. Skille hver av disse lagene er et viktig skritt for å etablere endometrial cellelinjer. Den perimetrium er det ytterste lag av uterus og består av tynne, serøse celler. Den myometrium er tykk, midtre lag av uterus og består av glatte muskelceller. Endometrium er identifisert som det indre laget av livmoren og omfatter epiteliale og stromal cellepopulasjoner.
Endometriet er videre delt inn i basalis lag som stamcelle befolkningen er en hypotese å befolke functionalis lag ca hver 28 dager en. Den functionalis lag av human endometrium gjennomgår betydelige biokjemiske og morfologiske endringer i respons til sirkulerende hormoner. Disse hormonene er avledet fra hypofysen og eggstokkene.
Denkoordinert produksjon og frigjøring av hormoner resultater i en reproduksjonssyklusen. Den reproduktive syklus er designet for å forberede endometriet for potensielle embryo implantasjon hendelser. Hos mennesker er den reproduktive syklus kjent som "menstruasjonssyklus", og deles inn i tre faser – proliferativ, sekretoriske, og menstruasjons. Proliferasjonsfasen innebærer spredning av functionalis livmor lag mens sekretoriske fasen er preget av functionalis modning. Spesielt ekstracellulære forandringer, sekreter, og cellulær differensiering signalisere en potensiell implantasjon. Ved implantasjonen ikke finner sted før slutten av den sekretoriske fase, er functionalis endometrial sjikt felle i løpet av menstruasjons fase. Betydningen av menstruasjon og de hendelser som utløser den utstøtingen av functionalis lag er fortsatt blir debattert. I mennesker er det blitt stilt at menstruasjonen er resultatet av en bestemt mid-sekretoriske fase differensiering hendelse kjentsom "spontan decidualization" to. I dette manuskriptet, gir vi detaljert metodikk for både endometrial stromal celle isolasjon metoder, og bruker en kombinasjon av immunfluorescens og digitale bilder for å demonstrere effekten av disse tilnærmingene. I tillegg har vi anvende en vanlig brukt in vitro modell av spontan decidualization å bekrefte endometrial stromal celleisolasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Andre grupper har beskrevet og tilpasset metodikk for utarbeidelse av endometrial stromal kulturer, de fleste som benytter collagenase 4,12,13,15-18. I dette manuskriptet, har vi gitt metodikk og dokumentasjon for to forenklede primære endometrial stromal kultur metoder, som begge benyttes av vår lab for økonomiske årsaker og den praktiske tilgjengeligheten av trypsin og / eller et barberblad.
Når man sammenligner våre to metoder, både med hell generere levedyktige primærk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de felles anstrengelser av Dr. Thao Dang og medlemmer av hennes lab for bruk av deres bildebehandling og mikroskop utstyr. Vi takker også Biorepository og Tissue Research Facility (BTRF) kjerne, Jeff Harper, og beboerne ved Universitetet i Virginia for å gi oss med livmor vev. Vi takker Karol Szlachta for hjelp med Skjematisk oversikt.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
References
- Heller, D., Heller, D. . in The endometrium: a clinicopathologic approach. , 56-75 (1994).
- Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
- Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
- Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
- Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
- Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
- Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
- Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
- Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
- Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
- Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
- Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
- Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
- Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
- Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
- Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
- . . American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , (2013).
- Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).
