Två metoder för att fastställa Primära Human Endometrial stromaceller från Hysterectomy Prover
Summary
Etablera primära endometrial stromal cellkultursystem från hysterektomi exemplar är en värdefull biologisk teknik och ett avgörande steg innan bedriva ett brett spektrum av forskning syftar. Här beskriver vi två metoder som används för att fastställa stromal kulturer från kirurgiskt resekterade endometrial vävnad i mänskliga patienter.
Abstract
Många försök har gjorts för att etablera sig i cellodlings vitro-system. Dessa system är konstruerade för att modellera ett stort antal in vivo-processer. Cellodlingssystem som härrör från mänskliga endometrial prover är inget undantag. Tillämpningar sträcker sig från normala cykliska fysiologiska processer till endometrial sjukdomar såsom gynekologisk cancer, infektionssjukdomar, och fortplantningsförmåga. Här ger vi två metoder för att fastställa primär endometrial stromaceller från kirurgiskt resekterade endometrial hysterektomi exemplar. Den första metoden kallas "skrapning Metoden" och införlivar mekanisk skrapning med kirurgiska eller rakblad medan den andra metoden benämns "trypsin-metoden". Denna senare metod använder den enzymatiska aktiviteten av trypsin för att främja separation av celler och primära cell utväxt. Vi illustrerar steg-för-steg-metod med hjälp av digitala bilder och mikroskopi. Vi provid ocksåe exempel för validering endometrial stromacellinjer via kvantitativa realtid polymeras kedjereaktioner (qPCR) och immunofluorescens (IF).
Introduction
Den mänskliga livmodern corpus innefattar tre skikt, det perimetrium (eller serosa), myometrium och endometrium. Skilja var och en av dessa lager är ett viktigt steg för att etablera endometrial cellinjer. Den perimetrium är den yttersta skiktet av livmodern och som är sammansatt av tunna, serösa celler. Myometrium är tjock, mellanskiktet av livmodern och består av glatta muskelceller. Endometrium identifieras som det inre skiktet av livmodern och inkluderar epiteliala och stromala cellpopulationer.
Den livmoderslemhinnan är vidare indelad i basalis lager vars stamceller befolkningen är en hypotes att återbefolka functionalis skiktet ungefär var 28 dagar 1. Det functionalis lagret av människo endometriet genomgår betydande biokemiska och morfologiska förändringar som svar på cirkulerande hormoner. Dessa hormoner härledda från hypofysen och äggstockarna.
Densamordnad produktion och frisättning av hormoner leder till en reproduktionscykel. Den reproduktiva cykeln är att förbereda livmoderslemhinnan för potentiella embryoimplantation händelser. Hos människa är den reproduktiva cykeln kallas "menstruationscykeln" och delas in i tre faser – proliferativ, sekretoriska och menstruation. Den proliferativa fasen innebär spridning av functionalis endometrial lagret medan den sekretoriska fasen präglas av functionalis mognad. Specifikt cellulära förändringar, sekret och cellulär differentiering signalerar en potentiell implantation. Om implantation inte sker före utgången av den sekretoriska fasen, är det functionalis endometrial lagret skjul under menstruationsfasen. Vikten av menstruation och de händelser som utlöser spridande av functionalis skiktet fortfarande diskuteras. Hos människor har man föreslagit att menstruationen är resultatet av en specifik medel sekretorisk differentieringsfasen händelsen kändsom "spontan decidualisering" 2. I detta manuskript ger vi detaljerad metod för både endometrial stromal cell isoleringsmetoder, och använda en kombination av immunofluorescens och digitala bilder för att påvisa effekten av dessa metoder. Dessutom tillämpar vi en vanligt förekommande in vitro modell för spontan decidualisering bekräfta endometrial stromal cellisolering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Andra grupper har beskrivits och anpassad metod för beredning av endometrial stromal kulturer, varav de flesta använder kollagenas 4,12,13,15-18. I detta manuskript har vi lämnat metodik och bevis för två förenklade primära endometrial stromal odlingsmetoder, som båda används av vårt labb av ekonomiska skäl och den bekväma tillgången till trypsin och / eller ett rakblad.
När man jämför våra två metoder, både framgångsrikt generera livskraftiga primära kulturer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar ett samarbete med Dr Thao Dang och medlemmar av hennes labb för användning av deras avbildning och mikroskoputrustning. Vi tackar också biorepository och Tissue Research Facility (BTRF) kärna, Jeff Harper, och de boende vid University of Virginia för att förse oss med livmodervävnad. Vi tackar Karol Szlachta för hjälpen med Schematisk översikt.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
References
- Heller, D., Heller, D. . in The endometrium: a clinicopathologic approach. , 56-75 (1994).
- Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
- Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
- Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
- Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
- Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
- Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
- Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
- Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
- Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
- Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
- Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
- Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
- Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
- Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
- Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
- . . American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , (2013).
- Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).
