Микрожидкостных основе Электрохимический Биочип для этикеток без анализа ДНК-гибридизации
Summary
Мы представляем микрофлюидных основе электрохимического биочип для выявления ДНК гибридизации. После оцДНК зонда функционализации, специфичность, чувствительность и предел обнаружения изучаются с дополнительными и некомплементарными целей оцДНК. Результаты иллюстрируют влияние гибридизации ДНК событий на электрохимической системы, с пределом обнаружения 3,8 нМ.
Abstract
Миниатюризация аналитических процедур настольных в микро-масштабе обеспечивает значительные преимущества в отношении времени реакции, стоимости и интеграции шагов предварительной обработки. Использование этих устройств к анализу гибридизации событий ДНК важна, поскольку она предлагает технологию для реальной оценки времени биомаркеров в точке оказания медицинской помощи для различных заболеваний. Однако, когда след устройство снижает доминирование различных физических увеличивается явлений. Эти явления влияют на точность изготовления и надежность работы устройства. Таким образом, существует большая потребность, чтобы точно изготовить и работать эти устройства в воспроизводимым образом, чтобы улучшить общую производительность. Здесь мы описываем протоколы и методы, используемые для изготовления и эксплуатации микрофлюидном основе электрохимического биочипа для точного анализа гибридизации ДНК событий. Биочип состоит из двух частей: Микрожидкостных чип стри параллельных микроканалы из полидиметилсилоксана (ПДМС), и 3 х 3 упорядоченной электрохимической микро-чип. Гибридизации ДНК события определяются с использованием электрохимического импеданса спектроскопия (EIS) анализ. Анализ EIS позволяет вариации мониторингу свойств электрохимической системы, преобладающих в этих масштабах длины. С возможностью отслеживать изменения как переноса заряда и диффузионного сопротивления с биосенсора, мы демонстрируем селективность к дополнительным целям оцДНК, вычисляемый предел обнаружения 3,8 нМ и 13% перекрестной реактивности с другими некомплементарной одноцепочечной ДНК следующий 20 мин инкубации. Эта методика может повысить производительность миниаппаратуры по выяснению от поведения диффузии в микро-масштабе режима и позволяя изучение гибридизации ДНК событий.
Introduction
Микрожидкостных лаборатория-на-чипе (LOC) устройства обеспечивают многочисленные преимущества в клинической диагностике, экологический мониторинг и медико-биологических исследований. Эти устройства используют микроканалов для управления потоком жидкости в регионах чипа, где целый ряд процедур может иметь место в том числе смешивания реагентов, близости, основанная связывания, передачи сигнала, и культивирования клеток 1-4. Microfluidics обеспечивает множество преимуществ по сравнению с обычными клинических диагностических инструментов, таких как планшете читателей или электрофоретических анализов гель сдвига. Микрожидкостных устройства требуют от 2 до 3 порядка (нанолитров в отличие от мкл) меньше реагентов для выполнения аналогичных анализов. Кроме того, эти устройства могут увеличить скорость, с которой некоторые биологические события происходят за счет меньшего удержания вида в каналах 5,6. В-третьих, датчики могут быть интегрированы в микрофлюидных устройств, использующих литографии и травления методы, которые могут обеспечить без наклеек detectioн. Наконец, эти устройства недороги в производстве и не требуют много работы по части техник для работы 7-10.
Этикетка без обнаружения обычно выполняется с помощью оптического или электрического преобразователя. Оптические приборы могут представить лучше зондирования производительность за счет снижения помех анализируемых веществ в образце. Тем не менее, их эффективность находится под угрозой в тех случаях, когда фон образца имеет ту же длину волны резонирующий в качестве датчика 11. Есть много преимуществ в использовании электрические сигналы для выполнения биологической и химической обнаружения в микрофлюидных систем. Изготовление изначально менее сложным, поскольку эти датчики обычно требуют только узорчатые электроды для работы. Кроме того, электрические сигналы могут быть непосредственно сопряжена с большей измерительного оборудования, тогда как другие формы сигналов может потребоваться преобразователь для преобразования сигнала 12-15. Электрические датчики обычно измерить изменения в impedancэ 16,17, емкость 18, или окислительно-восстановительный деятельность 19. Тем не менее, новые вызовы представлены как эти системы имеют очень маленькие размеры. Наиболее важные проблемы преодоления включают: подготовку образцов и смешивание жидкостей (за счет низкого объема выборки и числа Рейнольдса), физические и химические эффекты (включая капиллярных сил, шероховатость поверхности, химические взаимодействия между строительными материалами и анализируемых), низкий SIGNAL- к шуму (производства уменьшенной площади поверхности и объема) 20-23, и потенциальных помех от электро-активные аналитов в сложных биологических образцах (например, крови и слюне). Дальнейшие исследования этих эффектов приведет принципов для точного изготовления и эксплуатации этих устройств в воспроизводимым образом, что бы улучшить их общую производительность.
Обнаружение ДНК гибридизации широко используется для диагностики генетических заболеваний 24,25 и различные формы Канкунеэ 26. Каждый год, множество штаммов гриппа выявлены у пациентов, использующих результаты методами гибридизации ДНК 27. Вирус гриппа в одиночку приходится 36000 случаев смерти в год в Соединенных Штатах 28. Такие примеры могут извлечь выгоду из настольного микрожидкостных устройств, которые могут выполнять те же методы анализа, как планшет-ридера или гель сдвига анализа с низким объемом образца и на долю от стоимости без ущерба чувствительности или специфичности. В связи с многих преимуществ этикетки без электрохимической зондирования, это широко используется для обнаружения гибридизации ДНК событий 29,30. Установки, где макромасштабе электроды (в миллиметровом диапазоне) погружают в стаканы с раствором интерес, могут быть использованы для обеспечения очень чувствительные данные, касающиеся связывания кинетики одноцепочечных ДНК-последовательностей в их соответствующих комплементарных последовательностей. В последнее время было несколько достижений в включения электрохимического зондирования в MICRofluidics для гибридизации ДНК. Исследования проводились в отношении гибридизации кинетики 31 и интеграции датчиков для обнаружения 15 в микроканалов. Тем не менее, все еще существует потребность в быстром высокой пропускной микрофлюидного устройства, которое может анализировать ДНК-гибридизации события параллельно без необходимости выполнения сложных операций подготовки образца.
Устройство представлено в этой работе предоставляет платформу, которая позволяет несколько взаимодействия пройти обследование параллельно и без сложных процедуры подготовки пробы. Наш протокол представляет, как Микрожидкостных основе электрохимических биочипы микроизготовленном с микро-электромеханических систем (МЭМС) технологии 32,33. Опишем процесс изготовления как микрожидкостной чипа, изготовленного из полидиметилсилоксана (PDMS), и электрохимического чип, состоящий из массива электродов. Химический функционализацию биочипа с оцДНК зондов также рассматривается. И, наконец, Абилность биосенсора специально обнаружить и проанализировать оцДНК цели демонстрируется. В целом, Микрожидкостных на основе электрохимического биочип представляет собой быстрый и анализ высокой пропускной техники. Он может быть использован для исследования взаимодействия между биологическими молекулами и проводящих преобразователей, и может быть использовано в различных лаборатория-на-чипе приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наши процедуры демонстрируют изготовление микрофлюидном основе электрохимического биочипа и его использование для анализа гибридизации ДНК событий. Через высоким выходом контролируется процесс микроструктур мы разработать устройство, состоящий из микромасштабных каналов интегри…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают Robert W. Deutsch Foundation, обороны от угроз Агентство редукции (DTRA) и Национальный научный фонд Emerging Frontiers в исследования и инновации (Efri) за финансовую поддержку. Авторы также благодарят Мэриленд наноцентра и его Fablab для поддержки чистых помещений объекта.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
References
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -. H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. . Springer handbook of nanotechnology. , (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. . Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -. S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -. H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -. S., Marafie, A., Jia, X. -. Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
