Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip
Summary
Biz DNA hibridizasyon tespiti için mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal Bioçip sunuyoruz. SsDNA probu fonksiyonlandırmalar ardından, özgüllük, duyarlılık ve algılama limiti tamamlayıcı ve non-ssDNA hedefleri ile incelenmiştir. Sonuçlar 3.8 nM'lik bir algılama sınırı ile, elektro-kimyasal sistemine DNA hibridizasyonu olaylarının etkisini göstermektedir.
Abstract
Mikro ölçekli analitik olarak masa üstü prosedürler minyatür reaksiyon süresi, maliyet, ve ön-işlem basamağından entegrasyonu ile ilgili olarak önemli avantajlar sağlamaktadır. Bu noktadan-bakım çeşitli hastalıklar için en biyobelirteçlerinin gerçek zamanlı değerlendirilmesi için bir teknoloji sunuyor, çünkü DNA hibridizasyon olayların analizi doğru bu cihazları kullanan önemlidir. Bununla birlikte, söz konusu olduğunda cihaz izi çeşitli fiziksel olaylar artar hakimiyetini azaltır. Bu olgular fabrikasyon hassasiyet ve cihazın çalışma güvenilirliğini etkilemektedir. Bu nedenle, doğru bir genel performansını artırmak amacıyla tekrarlanabilir bir şekilde bu cihazların imal ve işletmek için büyük bir ihtiyaç vardır. Burada, protokoller ve imalat ve bunların DNA hibridizasyon etkinliği doğru analizi için bir mikro-akışkan-bazlı elektro kimyasal Biochip işlemi için kullanılan yöntemleri tarif eder. Biochipin iki bölümden oluşur: microfluidic çip ileÜç polydimetilsiloksan (PDMS) yapılan paralel mikro kanallar, ve 3 x 3 dizilmiş elektrokimyasal mikro-çip. DNA hibridizasyonu olaylarının elektrokimyasal empedans Spektroskopisi (EIS) analizi ile tespit edilir. ÇBS analizi, bu uzunluk ölçeklerinde baskın elektrokimyasal sistemin özelliklerinin izlenmesi varyasyonları sağlayan. Biosensörlü hem yük transferi ve difüzyon direnç değişiklikleri izlemek için yeteneği ile, 20 dakika aşağıdaki ssDNA hedeflerine seçiciliğini, 3.8 nM hesaplanmış saptama sınırı ve diğer tamamlayıcı olmayan ssDNA'ya ile% 13 çapraz reaktivite göstermiştir kuluçkadan. Bu metodoloji mikro ölçekli rejimi difüzyon davranışı üzerinde aydınlatılmasına ve DNA hibridizasyon olayların çalışmayı sağlayarak minyatür cihazların performansını artırabilirsiniz.
Introduction
Mikroakışkan lab-on-a-chip (KO) cihazları, klinik teşhis, çevresel izleme ve biyomedikal araştırmalarda sayısız avantajlar sağlamaktadır. Bu cihazlar, çok çeşitli prosedürler 1-4 kültürlenmesini reaktif karıştırma, bağlanma afinitesi göre, sinyal iletimi, ve hücre de dahil olmak üzere yer alabilir çipin bölgelerine sıvı akışını kontrol etmek için mikro-akışkan kanal kullanmaktadır. Mikroakiskan gibi mikro plaka okuyucuları veya elektroforetik jel kayma deneyleri gibi geleneksel klinik tanı araçları üzerinde birçok avantaj sağlar. Benzer deneyler gerçekleştirmek için daha az reaktifleri (mikrolitre karşıt olarak nanolitre) mikroakışkan cihazları büyüklüğünün 2-3 siparişler gerektirir. Ayrıca, bu cihazlar, bazı biyolojik olayları kanalların içindeki 5,6 türlerin daha küçük sınırlanmasından dolayı meydana hangi hızını artırabilir. Üçüncü olarak, sensörler etiketsiz detectio sağlayabilir litografi ve aşındırma teknikleri kullanılarak mikroakışkan cihazlar içinde de entegre edilebilirn. Son olarak, bu cihazlar üretmek ve 7-10 faaliyet teknisyen kısmında küçük çalışma gerektirir ucuzdur.
Etiket içermeyen algılama tipik olarak bir optik veya elektriksel transdüktör kullanılarak gerçekleştirilir. Optik aygıtları nedeniyle numunede analitlerle ile daha az müdahaleye daha iyi algılama performansı sunabilir. Bununla birlikte, bunların performansı numunesinin arka sensörü 11 ile aynı çınlayan dalga boyuna sahip olan durumlarda taviz verilmektedir. Akışkan sistemleri biyolojik ve kimyasal algılama gerçekleştirmek için elektrik sinyallerini kullanarak pek çok avantajı vardır. Bu sensörler genellikle sadece çalıştırmak için desenli elektrot gerektiren bu yana imalat doğası gereği daha az karmaşıktır. Diğer sinyal yöntemleri sinyali 12-15 dönüştürmek için bir transdüser gerekebilir ise ek olarak, elektrik sinyalleri doğrudan en ölçüm ekipmanları ile arabirim olabilir. Elektrik sensörleri yaygın impedanc değişiklikleri ölçmekE 16,17, kapasite 18 veya redoks aktivitesi 19. Bu sistemler minyatürize Ancak, yeni sorunlar sunulmaktadır. Üstesinden gelmek için en önemli zorluklar şunlardır: numune hazırlığı ve (nedeniyle düşük örnek hacmi ve Reynolds sayısına kadar) sıvı karıştırma, fiziksel ve kimyasal etkilere (kılcal kuvvetler dahil olmak üzere, yüzey pürüzlülüğü, inşaat malzemeleri ve Analitlerin arasındaki kimyasal etkileşimler), düşük sinyalizasyon karmaşık biyolojik örneklerin (örneğin, kan ve tükürük) elektro-aktif analitlerden 20-23, ve potansiyel girişim (azaltılmış yüzey alanı ve hacim tarafından üretilen) gürültü oranı. Bu etkilerin İleri araştırmalar genel performansını geliştirmek olan bir yeniden üretilebilir bir şekilde, bu cihazların doğru imalatı ve kullanımı için bir kılavuz ile sonuçlanacaktır.
DNA hibridizasyon tayini, genetik bozukluklar 24,25 ve Canc çeşitli biçimlerini teşhis etmek için yaygın olarak kullanılırer 26. Her yıl, grip suşları birden çok DNA hibridizasyon teknikleri 27 sonuçları kullanan hastalarda belirlenmiştir. Grip virüsü yalnız Amerika Birleşik Devletleri'nde 28 36.000 ölümlerin her yıl için hesapları. Bu gibi örnekler, duyarlılık veya spesifikliği ödün vermeden düşük bir örnek hacmi, bir plaka okuyucu ya da jel kayma deneyi olarak ve düşük bir maliyetle aynı deney teknikleri gerçekleştiren bir tezgah üstü mikro sıvısal tertibat yarar olabilir. Nedeniyle etiketsiz elektrokimyasal algılama pek çok avantajı nedeniyle, DNA hibridizasyonu olaylarının 29,30 saptanması için yaygın olarak kullanılmaktadır. (Milimetre aralığında) makro ölçekli elektrotlar ilgi çözeltisi beherler daldırılır bir kurulum doğrultusunda kendi tamamlayıcı dizileri tek şeritli DNA dizilerinin bağlanma kinetiği açısından çok hassas veri temin etmek üzere kullanılabilir. Son zamanlarda, MICR elektrokimyasal algılama içeren birkaç gelişmeler olmuşturDNA hibridizasyonu için ofluidics. Çalışmalar hibridizasyon kinetiği 31 ve mikroakışkan kanallarda tespiti için 15 sensörlerin entegrasyonu konusunda yapılmıştır. Bununla birlikte, hala karmaşık numune hazırlama adımları olmadan paralel DNA hibridizasyon olayları analiz edebilen hızlı bir yüksek verimli mikroakışkan cihaz için bir ihtiyaç vardır.
Bu çalışmada sunulan cihaz, çoklu etkileşimler paralel ve karmaşık numune hazırlama adımları olmadan ekranlı olması için izin veren bir platform sağlar. Bizim protokol elektrokimyasal biochip mikro-elektromekanik sistemler (MEMS) teknolojisi 32,33 ile mikrofabrike nasıl mikroakışkan tabanlı sunar. Bu elektrotlar, bir tertibinden oluşur (PDMS) polidimetilsiloksan mikroakışkan çip, çip ve hem de elektrokimyasal üretim süreci tarif eder. SsDNA probları ile biochipe kimyasal fonksiyonlandırılması da ele alınmaktadır. Son olarak, AbilÖzellikle ssDNA hedefleri tespit ve analiz etmek için biyosensör Sığ gösterilmiştir. Genel olarak, mikroakışkan-bazlı elektro kimyasal biyoçip hızlı ve yüksek hacimli bir analiz tekniğidir. Biyolojik moleküller ve iletken dönüştürücüler arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir, ve lab-on-a-chip çeşitli uygulamalar içinde kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim prosedürleri microfluidic tabanlı elektrokimyasal biochipe üretim ve DNA hibridizasyon olaylar analizi için kullanımı göstermektedir. Yüksek verim kontrollü mikroimalat süreçle elektrokimyasal dönüştürücüler bir dizi ile entegre mikro kanallar oluşan bir cihaz geliştirmek. Biz yinelemeli bir yaklaşımla elektrokimyasal çip ve mikroakışkan kanal kalıp fotolitografya prosedürü için kontrollü işlem parametrelerini tasarladılar. Bu adımlar diğer minyatür analitik cihazların gelecektek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar mali destek için Robert W. Deutsch Vakfı, Savunma Tehdit Azaltma Ajansı (DTRA), ve Araştırma Ulusal Bilim Vakfı Yükselen Frontiers ve Yenilik (EFRI) kabul. Yazarlar ayrıca temiz oda tesisi destek için Maryland Nanocenter ve FabLab teşekkür ederiz.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
References
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -. H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. . Springer handbook of nanotechnology. , (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. . Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -. S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -. H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -. S., Marafie, A., Jia, X. -. Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
