Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
Glycosylering een essentieel eiwit post-translationele modificatie, bijdraagt tot organismale fysiologie, pathologie weefsel en cellulaire herkenning 1-3. Ondanks de grote vooruitgang in de analytische glycoscience, het karakteriseren van de volledige diversiteit van glycanen op een specifiek eiwit blijft een zeer uitdagende taak, vooral op eiwitten geïsoleerd uit primaire biologische bronnen. Niettemin, de microheterogeniteit van glycoproteïne glycanen vaak invloed functionele interacties met andere eiwitten. Daarom karakterisering van glycan diversiteit is essentieel voor het begrijpen van de fysiologische betekenis van cellen en weefsels glycosylering 4,5. Om de bijdrage van glycoproteïne glycosylering om weefsel fysiologie en pathofysiologie, robuuste, gevoelige, en uitgebreide glycomic analytische technieken begrijpen steeds belangrijker geworden. In proteoomanalyses worden eiwitidentificaties algemeen bereikt door LC-MS/ MS analyse van tryptische peptiden 6. Eiwitvertering kan worden uitgevoerd met een gezuiverd eiwit of eiwitten gescheiden door SDS-PAGE na in-gel digestie met proteasen zoals trypsine 7-9. Voorverrijking van het eiwitmengsel door SDS-PAGE verhoogt de diepte en nauwkeurigheid eiwit ID. De ontwikkeling van analoge strategieën voor glycomic analyse van glycoproteïne glycosylering ligt in de voorhoede van glycoscience.
De twee belangrijkste klassen van glycanen worden door ofwel N-koppeling of O-koppeling aan eiwitskeletten bevestigd. N-gekoppelde glycanen zijn aan asparagine (Asn) residuen die als onderdeel van een sequon gedefinieerd als Asn-X-Ser / Thr / Cys (X elk aminozuur behalve proline), en kan worden vrijgemaakt door enzymatische digestie met peptide N -glycanase (PNGaseF of A), hetzij in oplossing, in-gel of blot op 10-12. O-gekoppelde glycanen zijn voornamelijk aan serine (Ser) of threonine (Thr) residuen. Echter, slechts één enzym is idenvaardigd dat kan vrijgeven O-gekoppelde glycanen van glycoproteïne en het heeft een zeer beperkt glycan specificiteit vrijgeven alleen de eenvoudige O-gekoppelde glycanen. Chemische releasestrategieën blijven voorkeursmethode voor uitgebreide afgifte van O-gekoppelde glycanen van glycoproteïnen. Reducerende of niet-reducerende β-eliminatie of hydrazinolyse goed gekarakteriseerde chemische afgifte technieken en zijn de meest gebruikte methoden voor het vrijgeven van O-gekoppelde glycanen van glycoproteïnen 13,14. Hoewel reductieve β-eliminatie is gebruikt om O-gekoppelde glycanen bevrijden van glycoproteïnen door SDS-PAGE, eerdere benaderingen nodig HPLC scheiding voor daaropvolgende analyse 15-17.
Multidimensional MS (MS n) analyse verschaft momenteel de rijkste bron van structurele gegevens voor het karakteriseren glycanen afgegeven uit glycoproteïnen die het verwachte meeste biologische bronnen bedragen. De diepte van MSgebaseerde structuurkarakterisering wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door permethylating de vrijgekomen glycanen vóór de analyse. Permethylation verbetert ionisatie en heeft de neiging om molaire signaal reacties te egaliseren over een breed scala van glycaanstructuren 18,19. Bovendien permethylation ondubbelzinnig labels terminal en monosaccharide eenheden met kenmerkende massa, waardoor structuuropheldering 20-23 verhogen. Bijvoorbeeld zure glycanen algemeen moeilijk te detecteren niet gepermethyleerd species MS. Hoewel zure glycanen negatieve ion modus kan worden gedetecteerd door MS, is het onmogelijk om zowel zure als neutrale glycanen detecteren in dezelfde ionenmodus. Een groot voordeel van glycan permethylation is dat alle vrije hydroxylgroepen (OH) op monosaccharide substituenten een glycan zal worden afgesloten met een methylgroep (OCH3 of OMe), dus een gesialyleerde glycaan de kosten geneutraliseerd, waardoor ze detecteerbare als gepermethyleerd neutraal (aziëlo) glycanen. De hydroxylgroepen van sulfaat groepen op sulfoglycans zijn bestand tegen permethylation, waardoor retentie van anionische lading, die ionisatie onderdrukt en vermindert gevoeligheid. Deze onderdrukking voorkomt nog glycomic uitgebreide analyse van zeer complexe glycoproteïnen zoals mucinen, die een grote dichtheid aan gesulfateerde 24-26 glycanen dragen.
Recente rapporten over de zuiverende gesulfateerde glycanen gebruikte gebracht, omgekeerde fase chromatografie te zuiveren en aparte gepermethyleerd glycanen voorafgaand aan MALDI-analyse. Deze werkwijze berust op volledige scheiding van gesulfateerde en niet-gesulfateerde glycanen met verschillende mobiele fasen voor elutie, die we hebben gevonden minder stringent dan organische fase verdeling zijn. Daarom zijn nieuwe technieken geschikt voor de detectie en verrijking van sulfoglycans hier gepresenteerd. Deze technieken zorgen voor de kwantitatieve herstel van gesulfateerde glycanen in de waterfase volgende water: DCM (dichloormethaan)extractie, die routinematig wordt uitgevoerd aan het einde van glycan permethylation 27 reacties. Belangrijk is dat deze robuuste scheiding van gepermethyleerd sulfoglycans uit een mengsel van gepermethyleerd niet-gesulfateerde glycanen gelijktijdig verrijkt voor geladen deeltjes, terwijl ook de vereenvoudiging van MS 2 fragmentatiepatronen. Een uitgebreide protocol voor betere in-gel-O-gelinkte glycan analyse wordt gepresenteerd. De verbeterde protocol verbetert glycan herstel, verhoogt de structurele informatie verkregen door middel van MS n analyse van gepermethyleerd glycanen, en verbetert de gevoeligheid van toepassing op essentiële glycoproteïnen geïsoleerd uit biologische bronnen sulfoglycomic analyses.
Dit protocol is bedoeld voor O-gekoppelde glycan analyse van hele glycoproteïne extracten of een specifiek glycoproteïne van belang opgelost door SDS-PAGE en bestaat uit drie experimentele procedures; A) gel clean-up, B) in-gel reductieve β-eliminatie, en C) glycan permethyning. Het doel is om omvangrijke O-gekoppelde glycomic gegevens te verkrijgen voor glycoproteïnen geoogst uit primaire bronnen van biologisch belang (figuur 1). Glycoproteïnen door SDS-PAGE worden gevisualiseerd door kleuring en banden van belang worden uitgesneden en de resulterende gel band wordt gesneden in kleine stukjes. De gel stukken worden ontkleurd en onderworpen aan ethylacetaat wassen gel verontreinigingen (Figuur 2A) verwijderd. Glycaan afgifte wordt bereikt door in-gel reductieve β-eliminatie (Figuur 2B) en de vrijgekomen glycanen gepermethyleerd. Waterige organische extractie volgende permethylation kwantitatief partities de anionische gesulfateerde glycanen weg van niet-gesulfateerde neutraal glycanen (figuur 2C). In-gel reductieve β-eliminatie gekoppeld waterige organische extractie maakt de karakterisering van O-gekoppelde glycanen en sulfoglycans bezit van kleine hoeveelheden glycoproteïne door SDS-PAGE. Het strategisch overzicht is summarized in figuur 1 en de details zijn weergegeven in figuur 2. Bovendien kan een gedeelte van de gel ontkleurd en gewassen stukken worden gebruikt door standaard eiwit ID LC-MS / MS-proteomica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an ‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
