Amélioration dans le gel sulfo-réductrices glycomique β-élimination complète pour O-liés et par spectrométrie de masse
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
La glycosylation est une modification de post-traductionnelle des protéines essentielles, ce qui contribue à la physiologie organismal, la pathologie des tissus, et de la reconnaissance cellulaire 3.1. Malgré les importants progrès glycoscience analyse, la caractérisation de la diversité complète des glycanes sur une protéine spécifique reste une tâche extrêmement difficile, en particulier sur les protéines isolées à partir de sources biologiques primaires. Néanmoins, la microhétérogénéité de glycanes des glycoprotéines affecte fréquemment les interactions fonctionnelles avec d'autres protéines. Par conséquent, la caractérisation de la diversité glycane est essentielle pour comprendre la signification physiologique de cellulaire et tissulaire glycosylation 4,5. Afin de comprendre la contribution de la glycoprotéine glycosylation à la physiologie et la physiopathologie de tissu, robuste, sensible, et les techniques d'analyse glycomic complets sont devenus de plus en plus importante. Dans l'analyse protéomique, les identifications de protéines sont généralement obtenus par LC-MS/ Analyse des peptides tryptiques 6 MS. La digestion des protéines peut être réalisée en utilisant une protéine purifiée ou les protéines résolues par SDS-PAGE après digestion in-gel avec des protéases telles que la trypsine 7-9. Pré-enrichissement du mélange de protéines par SDS-PAGE et améliore la précision de la profondeur de la protéine ID. L'élaboration de stratégies analogues pour l'analyse de la glycoprotéine glycomic glycosylation se trouve à la pointe de glycoscience.
Les deux grandes classes de glycanes sont attachés à des squelettes de protéines, soit par N-lien ou O-lien. Glycanes N-liés sont liés à l'asparagine (Asn) des résidus trouvés dans le cadre d'un Séquon défini comme Asn-X-Ser / Thr / Cys (X est n'importe quel acide aminé excepté la proline), et peut être libéré par la digestion enzymatique avec la peptide N -glycanase (PNGaseF ou A), soit en solution, en gel, ou sur-blot 10-12. glycanes O-liés sont principalement liés à la serine (Ser) ou threonine (Thr) les résidus. Cependant, seule une enzyme a été identifié qui est capable de libérer glycanes O-liés de glycoprotéine et elle a une spécificité extrêmement limité glycane, en libérant seulement les glycanes O-liés plus simples. stratégies de déversement de produits chimiques demeurent la méthode de choix pour la libération complète de glycanes O-liés de glycoprotéines. Β-élimination réductrice ou non réductrice, ou hydrazinolyse sont des techniques chimiques de démoulage bien caractérisés et sont actuellement les méthodes les plus couramment utilisées pour libérer glycanes O-liés de glycoprotéines 13,14. Bien que la β-élimination réductrice a été utilisé pour libérer des glycanes O-liés de glycoprotéines séparées par SDS-PAGE, les approches antérieures doivent séparation par HPLC de 15 à 17 pour une analyse ultérieure.
Multidimensionnelle MS (MS n) analyse fournit actuellement la plus riche source de données structurelles pour la caractérisation des glycanes libérés de glycoprotéines isolées dans les montants que la plupart des sources biologiques. La profondeur de MScaractérisation structurale à base est grandement facilitée par permethylating les glycanes libérés avant leur analyse. Perméthylation ionisation augmente et tend à égaliser les réponses de signaux molaires dans un large éventail de structures de glycanes 18,19. En outre, perméthylation balises sans ambiguïté groupements oses terminaux et substitués avec des masses distinctes, renforçant ainsi élucidation de la structure 20-23. Par exemple, les acides glycanes sont généralement difficiles à détecter que les espèces non perméthylé par MS. Bien que les glycanes acides peuvent être détectés en mode d'ions négatifs par MS, il est impossible de détecter à la fois acides et neutres glycanes dans le même mode d'ions. Un avantage majeur de la perméthylation glycane est que tous les groupes hydroxyle libres (OH) sur substituants monosaccharide d'un glycane sera coiffée par un groupe méthyle (OCH 3 ou OMe), ainsi les charges d'un sialylées glycane sont neutralisés, ce qui les rend aussi détectable comme perméthylé neutre (Asielo) glycanes. Cependant, les hydroxyles de groupements sulfate sur sulfoglycans sont résistants à perméthylation, résultant de la rétention de charge anionique, qui supprime l'ionisation et diminue la sensibilité. Cette suppression empêche actuellement l'analyse glycomic complète des glycoprotéines très complexes tels que les mucines, qui portent une grande abondance de glycanes sulfatés 24-26.
Des rapports récents sur purification sulfaté glycanes ont utilisé facturés, la chromatographie en phase inverse pour purifier et glycanes perméthylés séparés avant analyse MALDI. Cette méthode repose sur la séparation complète de glycanes sulfatés et non sulfatés en utilisant différentes phases mobiles pour élution, que nous avons trouvé à être moins sévères que le partitionnement de phase organique. Par conséquent, de nouvelles techniques adaptées à la détection et à l'enrichissement de sulfoglycans sont présentés ici. Ces techniques permettent la récupération quantitative de glycanes sulfatés dans la phase aqueuse après l'eau: DCM (dichlorométhane)extraction, qui est habituellement effectuée à la fin des réactions d'perméthylation 27 glycane. Surtout, cette séparation robuste de sulfoglycans perméthylés partir d'un mélange de glycanes non sulfatés perméthylés enrichit en même temps que pour les espèces chargées tout en simplifiant MS 2 modèles de fragmentation. Un protocole complet pour une meilleure analyse des glycanes en gel O-liés sont également présentés. Le protocole amélioré améliore la récupération glycane, augmente l'information structurelle pouvant être obtenu par le biais de l'analyse MS n glycanes perméthylés, et améliore la sensibilité des analyses sulfoglycomic appliquées aux glycoprotéines essentielles isolés à partir de sources biologiques.
Ce protocole est destiné à l'analyse glycane O-lié de glycoprotéiques extraits entiers ou d'une glycoprotéine d'intérêt spécifique résolu par SDS-PAGE et est composé de trois procédures expérimentales; A) un gel de nettoyage, B) dans le gel β-élimination réductrice, et C) permethy glycanelation. L'objectif est d'obtenir des données complètes glycomic O-liés pour glycoprotéines récoltés à partir de sources primaires d'intérêt biologique (figure 1). Glycoprotéines séparées par SDS-PAGE sont visualisés par coloration et bandes d'intérêt sont excisées et la bande de gel résultant est découpé en petits morceaux. Les morceaux de gel sont décolorées et soumis à des lavages à l'acétate d'éthyle pour éliminer les contaminants de gel (Figure 2A). Libération de glycane est obtenu par en-gel β-élimination réductrice (figure 2B) et les glycanes libérés sont perméthylée. Aqueux-organique extraction perméthylation suivant répartit quantitativement les anioniques sulfatés glycanes loin de glycanes neutres non sulfatés (figure 2C). In-gel β-élimination réductrice couplé à une extraction aqueuse-organique permet la caractérisation des glycanes et sulfoglycans O-liés libérés de petites quantités d'une glycoprotéine séparés par SDS-PAGE. La vision stratégique est summarized sur la figure 1 et les détails sont présentés dans la figure 2. En outre, une partie des morceaux de gel décolorées et lavé peut être utilisé pour une protéine par des techniques protéomiques ID standards LC-MS / MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an ‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
