Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
Glykosylierung ist eine wesentliche Protein posttranslationale Modifikation, einen Beitrag zu organismal Physiologie, Gewebepathologie und zelluläre Erkennungs 1-3. Trotz großer Fortschritte in der analytischen Glycoscience, Charakterisierung der komplette Vielfalt der Glykane auf ein spezifisches Protein bleibt eine äußerst schwierige Aufgabe, vor allem auf Proteine aus primären biologischen Quellen isoliert. Dennoch ist die Mikroheterogenität von Glycoprotein Glykane betrifft häufig funktionelle Wechselwirkungen mit anderen Proteinen. Daher ist die Charakterisierung von Glykan Vielfalt für das Verständnis der physiologischen Bedeutung der Zell- und Gewebe Glykosylierung 4,5. Um den Beitrag der Glykoprotein Glykosylierung an Gewebe Physiologie und Pathophysiologie, robust, sensibel, und umfassende glycomic Analysetechniken verstehen immer wichtiger geworden. In Proteomanalyse werden Proteinidentifikationen im Allgemeinen durch LC-MS erreicht/ MS-Analyse der tryptischen Peptide 6. Proteinverdauung kann mit einem gereinigten Protein oder Proteine durch SDS-PAGE aufgelöst folgenden in-Gel-Verdau mit Proteasen, wie Trypsin 7-9 durchgeführt werden. Voranreicherung des Proteingemisches durch SDS-PAGE erhöht die Tiefe und die Genauigkeit der Protein ID. Die Entwicklung analoger Strategien für glycomic Analyse Glykoprotein Glykosylierung liegt an der Spitze der Glycoscience.
Die zwei Hauptklassen von Glycanen auf Proteingerüste entweder durch N-Bindung oder O-Verknüpfung gebunden ist. N-verknüpfte Glykane an Asparagin gebunden (Asn) -Reste als Teil einer Sequon definiert als Asn-X-Ser / Thr / Cys gefunden (X ist eine beliebige Aminosäure außer Prolin), und kann durch enzymatischen Verdau mit Peptid-N veröffentlicht -glycanase (PNGaseF oder A), entweder in Lösung, in-Gel oder auf dem Blot 10-12. O-Glycane werden hauptsächlich zu Serin (Ser) oder Threonin (Thr) Reste gebunden. Jedoch nur ein Enzym ist idenziert, die fähig sind zum Frei O-verknüpften Glykanen von Glykoprotein, und es hat eine extrem begrenzte Glykan Spezifität Lösen nur die einfachsten O-verknüpften Glykanen. Chemische Freigabestrategien bleiben die Methode der Wahl für die umfassende Veröffentlichung von O-verknüpften Glykane von Glykoproteinen. Reduzierenden oder nicht-reduzierenden β-Eliminierung oder Hydrazinolyse gut charakterisiert sind chemische Trenntechniken und sind derzeit die am häufigsten verwendeten Ansätze zum Lösen O-verknüpften Glykanen von Glykoproteinen 13,14. Obwohl die reduktive β-Eliminierung wurde verwendet, um O-verknüpften Glykanen von Glykoproteinen durch SDS-PAGE getrennt lösen, benötigt früheren Ansätzen HPLC-Trennung für die anschließende Analyse 15-17.
Mehrdimensionale MS (MS n) Analyse liefert derzeit die reichste Quelle von Strukturdaten zur Charakterisierung Glykane von Glykoproteinen isoliert in den von den meisten biologischen Quellen erwarteten Mengen freigesetzt. Die Tiefe der MS-basierte strukturelle Charakterisierung wird stark durch permethylating die frei Glykane vor ihrer Analyse erleichtert. Permethylierung verbessert Ionisation und neigt dazu, molare Signalantworten in einem breiten Spektrum von Glykanstrukturen 18,19 auszugleichen. Darüber hinaus Permethylierung eindeutig Tags Terminal und substituierte Monosaccharideinheiten mit unverwechselbaren Massen, wodurch Strukturaufklärung 20-23. Beispielsweise sind saure Glykane im allgemeinen schwierig, nicht-permethyliertes Arten von MS zu erfassen. Obwohl saure Glycane können in negativen Ionenmodus durch MS nachgewiesen werden kann, ist es unmöglich, beide sauren und neutralen Glykanen in der gleichen Ionenmodus zu detektieren. Ein Hauptvorteil der Glycan Permethylierung ist, dass alle freien Hydroxylgruppen (OH) an Monosaccharid Substituenten ein Glykan mit einer Methylgruppe (OCH 3 oder OMe), wodurch eine sialylierte Glycane der Ladungen neutralisiert werden verschlossen werden, so dass sie als detektierbare als permethyliertem neutral (asialo) Glykane. Jedoch sind die Hydroxylgruppen des Sulfateinheiten auf sulfoglycans beständig Permethylierung, was Retention anionischer Ladung, die Ionisation unterdrückt und die Empfindlichkeit verringert. Diese Unterdrückung verhindert derzeit umfangreiche glycomic Analyse von sehr komplexen Glykoproteine wie Mucinen, die eine hohe Häufigkeit von sulfatierten Glycanen 24-26 tragen.
Jüngste Berichte über Reinigungs sulfatierte Glykane Verwendung geladen, Reverse-Phase-Chromatographie zu reinigen und zu separaten permethylierten Glykane vor MALDI-Analyse. Dieses Verfahren beruht auf der vollständigen Trennung von sulfatierten und nicht-sulfatierten Glycanen mit verschiedenen mobilen Phasen zur Elution, die wir gefunden haben, die weniger streng als organische Phasentrennung zu sein. Daher sind neue Methoden zur Detektion und Anreicherung sulfoglycans hier vorgestellt. Diese Techniken erlauben die quantitative Rückgewinnung von sulfatierter Glycane in der wässrigen Phase nach der Wasser: DCM (Dichlormethan)Extraktion, die regelmäßig am Ende des Glycan Permethylierung Reaktionen 27 durchgeführt wird. Wichtig ist, dass diese robuste Trennung von permethyliertes sulfoglycans aus einer Mischung von permethyliertes nicht-sulfatierte Glykane gleichzeitig bereichert für geladene Spezies gleichzeitig vereinfacht MS2 Fragmentierungsmuster. Eine umfassende Protokoll für verbesserte in-Gel-O-gebundene Glycan-Analyse wird ebenfalls vorgestellt. Das verbesserte Protokoll verbessert glycan Recovery, erhöht die strukturelle Informationen erhältlich durch MS n Analyse permethyliertes Glykane und verbessert die Empfindlichkeit um wesentliche Glykoproteine aus biologischen Quellen isoliert angewendet sulfoglycomic Analysen.
Dieses Protokoll wird für O-gebundene Glycan Analyse ganzer Glykoprotein Extrakte oder eines bestimmten Glykoproteins von Interesse durch SDS-PAGE bestimmt, und ist aus drei Versuchsverfahren besteht; A) Gel-clean-up, B) In-Gel reduktive β-Eliminierung und C) Glycan permethynung. Das Ziel ist es, umfassende O-verknüpften glycomic Daten für Glykoproteine aus Primärquellen von biologischem Interesse (Abbildung 1) geerntet erhalten. Glycoproteine durch SDS-PAGE getrennt werden durch Färben und interessante Banden werden herausgeschnitten und das resultierende Gel Band wird in kleine Stücke geschnitten visualisiert. Die Gelstücke werden entfärbt und Ethylacetat Waschungen unterworfen, um Verunreinigungen Gel (2A) zu entfernen. Glycan Freisetzung wird durch In-Gel reduktive β-Eliminierung (2B) erreicht, und die Freigabe Glycane permethyliert werden. Wässrig-organischen Extraktions folgenden Permethylierung quantitativ Partitionen Die anionische sulfatierte Glykane vom nicht-sulfatierten neutrale Glykane (2C). In-Gel reduktive β-Eliminierung zu wässrig-organischen Extraktions gekoppelt ermöglicht die Charakterisierung von O-verknüpften Glykanen und sulfoglycans von kleinen Mengen von Glykoprotein durch SDS-PAGE getrennt freigegeben. Die strategischen Überblick ist summarized in Figur 1 und die Einzelheiten sind in Figur 2 gezeigt. Zusätzlich kann ein Teil der entfärbt und gewaschen Gelstücke Protein ID durch Standard LC-MS / MS Proteomiktechniken verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
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