השתפר בג'ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
Glycosylation היא שינוי חלבון לאחר translational חיוני, תורם לפיזיולוגית האורגניזם, פתולוגיה רקמה, והכרה סלולרית 1-3. למרות התקדמות גדולה בglycoscience אנליטיים, המאפיין את הגיוון של glycans המלא על חלבון מסוים נותרת משימה מאוד מאתגרת, במיוחד בחלבונים מבודדים ממקורות ביולוגיים ראשוניים. יחד עם זאת, microheterogeneity של glycans גליקופרוטאין לעתים קרובות משפיע על אינטראקציות פונקציונליות עם חלבונים אחרים. לכן, אפיון של מגוון סוכרים חיוני להבנת המשמעות הפיזיולוגית של 4,5 glycosylation הסלולרי ורקמה. על מנת להבין את תרומתם של glycosylation גליקופרוטאין לפיזיולוגית רקמה ופיזיולוגית, חזק, רגיש, וטכניקות אנליטיות glycomic מקיפות הפכו חשוב יותר ויותר. בניתוח proteomic, הזדהויות חלבון בדרך כלל מושגת על ידי LC-MS/ ניתוח MS של פפטידים tryptic 6. עיכול חלבון יכול להתבצע באמצעות חלבון מטוהר או חלבונים נפתר על ידי SDS-עמוד הבא עיכול ב- ג'ל עם פרוטאזות כגון טריפסין 7-9. טרום העשרת תערובת החלבונים על ידי SDS-PAGE משפרת את העומק ודיוק של זיהוי חלבון. פיתוח אסטרטגיות דומות לניתוח glycomic של glycosylation גליקופרוטאין נמצא בחוד החנית של glycoscience.
שני סוגים העיקריים של glycans מחוברים לשדרת חלבונים באמצעות שני N-הצמדה או O-הצמדה. glycans N הצמוד צמודים לasparagine (ASN) שאריות נמצאו כחלק מsequon המוגדר כASN-X-Ser / Thr / Cys (X הוא כל חומצת אמינו מלבד פרולין), ויכול להיות שפורסם על ידי עיכול אנזימטי עם N peptide- -glycanase (PNGaseF או), או בפתרון, בג'ל, או בכתם 10-12. glycans צמוד O בעיקר מחובר לסרין (Ser) או תראונין שאריות (Thr). עם זאת, רק אחד אנזים כבר IDENtified כי הוא מסוגל לשחרר glycans צמוד O מגליקופרוטאין ויש לה ייחוד סוכרים מוגבל מאוד, משחרר רק glycans צמוד O הפשוט. אסטרטגיות שחרור כימי תישאר שיטת בחירה של שחרור מקיף של glycans צמוד O מגליקופרוטאינים. β-חיסול מצמצם או שאינו מצמצם, או hydrazinolysis טכניקות שחרור כימי מאופיינות היטב וכיום הגישות הנפוצות ביותר לשחרור glycans הצמוד O מגליקופרוטאינים 13,14. למרות β-חיסול מצמצם נעשה שימוש כדי לשחרר glycans צמוד O מגליקופרוטאינים מופרדים על ידי SDS-PAGE, גישות קודמות נדרשות הפרדת HPLC לניתוח שלאחר מכן 15-17.
ניתוח רב-ממדים של MS (הטרשת הנפוצה n) מספק כיום המקור העשיר ביותר של נתונים מבניים לאפיון glycans שוחרר מגליקופרוטאינים המבודדים בכמויות הצפויות מרוב המקורות ביולוגיים. העומק של MSאפיון מבני מבוסס הוא הקל מאוד על ידי permethylating glycans שוחרר לפני הניתוח שלהם. Permethylation משפר יינון ונוטה להשוות אות תגובות טוחנות על פני מגוון רחב של מבני סוכרים 18,19. בנוסף, באופן חד משמעי permethylation תגי moieties מסוף והחליפה monosaccharide עם המונים ייחודיים, ובכך משפרת את ההבהרה מבנית 20-23. לדוגמא, glycans חומצי קשה בדרך כלל לזהות כמינים-permethylated לא על ידי MS. למרות שניתן לאתרם glycans חומצי במצב יון שלילי על ידי MS, אי אפשר לזהות גם glycans חומצי וניטראלי באותו מצב היון. יתרון עיקרי של permethylation סוכרים הוא שכל הקבוצות חופשיות הידרוקסיל (OH) במתמירים monosaccharide של סוכרים יהיו כתרים עם קבוצה מתיל (och 3 או שת), ובכך החיובים של סוכרי sialylated מנוטרלים, מה שהופך אותם כגילוי כpermethylated ניטראלית (אסיה) Glycans lo. עם זאת, hydroxyls של moieties סולפט בsulfoglycans עמיד בפני permethylation, וכתוצאה מכך בשייר תשלום אניוני, המדכא יינון והירידה ברגישות. דיכוי זה כיום מונע ניתוח glycomic המקיף של גליקופרוטאינים מורכבים מאוד כגון mucins, אשר נושאים שפע גבוה של glycans הגופריתי 24-26.
הדיווחים אחרונים על glycans טיהור הגופריתית השתמשו טעונים, כרומטוגרפיה הפוכה שלב טיהור וglycans permethylated הנפרד לפני ניתוח MALDI. שיטה זו מסתמכת על הפרדת glycans הגופריתי ולא-הגופריתי באמצעות שלבים שונים ניידים לelution, שבו אנו מצאנו להיות מחמירים פחות ממחיצות שלב אורגניות מלאה. לכן, טכניקות חדשות מתאימות לאיתור והעשרת sulfoglycans מוצגות כאן. טכניקות אלו מאפשרות ההתאוששות כמותית של glycans הגופריתי בשלב המימי הבאה מים: DCM (dichloromethane)חילוץ, שמבוצע באופן שוטף בסוף תגובות permethylation סוכרי 27. חשוב לציין, הפרדה החזקה של sulfoglycans permethylated מתערובת של glycans שאינו גופריתי permethylated מעשירה במקביל למינים טעונים בעת גם לפשט MS 2 דפוסי פיצול. פרוטוקול מקיף לניתוח צמוד O משופר בג'ל סוכרים מוצג גם. הפרוטוקול המשופר משפר התאוששות סוכרים, מעלה את המידע המבני בר השגה באמצעות MS n ניתוח של glycans permethylated, ומשפר את הרגישות של ניתוחי sulfoglycomic להחיל גליקופרוטאינים חיוניים מבודדים ממקורות ביולוגיים.
פרוטוקול זה מיועד לניתוח סוכרים צמוד O של תמציות גליקופרוטאין כולה או של גליקופרוטאין ספציפי של עניין ייפתר על ידי SDS-PAGE והוא מורכב משלוש הפרוצדורות; ניקוי ג'ל), ב ') β-חיסול מצמצם בג'ל, ו- C) permethy סוכריםlation. המטרה היא להשיג נתונים glycomic צמוד O מקיפים לגליקופרוטאינים שנקטפו ממקורות ראשוניים של עניין ביולוגי (איור 1). גליקופרוטאינים מופרדים על ידי SDS-PAGE הם דמיינו על ידי צביעה ולהקות של עניין הם נכרת ולהקת ג'ל וכתוצאה מכך נחתכה לחתיכות קטנות. חתיכות ג'ל destained ונתונים לשטיפת אתיל אצטט להסרת מזהמי ג'ל (איור 2 א). שחרור סוכרים מושגת על ידי β-חיסול מצמצם ב- ג'ל (איור 2) וglycans שוחרר הם permethylated. permethylation החילוץ ימי-האורגני הבא כמותית מחיצות glycans אניוני גופריתית מglycans שאינו גופריתי הניטרלי (איור 2 ג). בג'ל β-חיסול מצמצם מצמידים את המיצוי המימי-אורגני מאפשר אפיון של glycans צמוד O וsulfoglycans שוחרר מכמויות קטנות של גליקופרוטאין מופרד על ידי SDS-PAGE. הסקירה האסטרטגית היא summariZed באיור 1 והפרטים מוצג באיור 2. בנוסף, חלק מחתיכות ג'ל destained ורחצו יכול לשמש לזיהוי חלבון על ידי טכניקות proteomic LC-MS / MS סטנדרטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an ‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
