Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
La glicosilación es una modificación esencial de proteína después de la traducción, lo que contribuye a la fisiología del organismo, patología del tejido, y el reconocimiento celular 1-3. A pesar de los grandes avances en glicociencia analítica, la caracterización de la diversidad completa de glicanos en una proteína específica sigue siendo una tarea extremadamente difícil, sobre todo en las proteínas aisladas de fuentes biológicas primarias. No obstante, la microheterogeneidad de glicanos de glicoproteínas con frecuencia afecta a las interacciones funcionales con otras proteínas. Por lo tanto, la caracterización de la diversidad glicano es esencial para la comprensión de la importancia fisiológica de celular y tisular 4,5 glicosilación. A fin de comprender la contribución de glicosilación glicoproteína a la fisiología y la fisiopatología del tejido, robusto, sensible, y técnicas analíticas integrales glycomic han vuelto cada vez más importante. En el análisis proteómico, identificación de proteínas se obtienen generalmente por LC-MS/ MS análisis de péptidos trípticos 6. La digestión de proteínas puede llevarse a cabo usando una proteína o proteínas purificadas resueltas por SDS-PAGE después de la digestión en gel con proteasas tales como tripsina 7-9. Pre-enriquecimiento de la mezcla de proteínas por SDS-PAGE aumenta la profundidad y exactitud de ID de la proteína. El desarrollo de estrategias análogas para el análisis glycomic de glicosilación glicoproteína se encuentra a la vanguardia de la glicociencia.
Las dos clases principales de glicanos están unidos a cadenas principales de proteínas a través de cualquiera de ligamiento o N-O-vinculación. Glicanos ligados a N están unidos a asparagina (Asn) residuos que se encuentran como parte de un sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X es cualquier aminoácido excepto prolina), y puede ser liberado por digestión enzimática con péptido-N -glycanase (PNGasaF o A), ya sea en solución, en gel, o en-blot 10-12. Glicanos O-ligados están asociadas principalmente a serina (Ser) o treonina (Thr) residuos. Sin embargo, sólo una enzima ha sido identificado que es capaz de liberar glicanos O-ligados de glicoproteína y tiene una especificidad glicano extremadamente limitada, liberando sólo los glicanos O-ligados simples. Estrategias de las emisiones químicas siguen siendo el método de elección para la liberación integral de glicanos O-ligados de glicoproteínas. Β-eliminación reductora o no reductora, o hidrazinolisis son técnicas de liberación química bien caracterizados y son actualmente los métodos más comúnmente utilizados para la liberación de los glicanos O-vinculado glicoproteínas de 13,14. Aunque reductora β-eliminación se ha utilizado para liberar los glicanos O-ligados de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, los enfoques anteriores requieren separación por HPLC para el análisis posterior 15-17.
Análisis multidimensional MS (MS n) actualmente proporciona la fuente más rica de los datos estructurales para la caracterización de los glicanos liberados de glicoproteínas aisladas en las cantidades que se espera de la mayoría de fuentes biológicas. La profundidad de la EMcaracterización estructural basado ve facilitada en gran medida por permethylating los glicanos liberados antes de su análisis. Permetilación mejora la ionización y tiende a igualar las respuestas de señal molares través de una amplia gama de estructuras de glicano 18,19. Además, permetilación etiquetas inequívocamente restos de monosacáridos terminales y sustituidos con masas distintivos, mejorando así la elucidación estructural 20-23. Por ejemplo, los glicanos ácidos son generalmente difíciles de detectar como especies no permetilado por MS. Aunque glicanos ácidas se pueden detectar en modo de iones negativos por MS, es imposible detectar tanto glicanos ácidos y neutros en el mismo modo de iones. Una ventaja importante de permetilación glicano es que todos los grupos hidroxilo libres (OH) en sustituyentes de monosacáridos de un glicano se tapó con un grupo metilo (OCH 3 o OMe), por lo tanto los cargos de un sialilados glicano se neutralizan, por lo que como detectable como permetilado neutral (AsiaLO) glicanos. Sin embargo, los hidroxilos de restos de sulfato en sulfoglycans son resistentes a la permetilación, lo que resulta en la retención de carga aniónica, que suprime la ionización y disminuye la sensibilidad. Esta supresión actualmente impide el análisis glycomic integral de glicoproteínas muy complejas, como las mucinas, que llevan una gran abundancia de glicanos sulfatados 24-26.
Informes recientes sobre purificadores de glicanos sulfatados usado cargado, cromatografía de fase inversa para purificar y glicanos permetilados separadas antes del análisis MALDI. Este método se basa en la separación completa de glicanos sulfatados y no sulfatados utilizando diferentes fases móviles para la elución, lo que hemos encontrado para ser menos estrictas que el particionamiento fase orgánica. Por lo tanto, las nuevas técnicas adecuadas para la detección y el enriquecimiento de sulfoglycans se presentan aquí. Estas técnicas permiten la recuperación cuantitativa de glicanos sulfatados en la fase acuosa de agua siguiente: DCM (diclorometano)extracción, que se realiza rutinariamente en el extremo de reacciones permetilación de glicano 27. Es importante destacar que esta robusta separación de sulfoglycans permetilados de una mezcla de glicanos sulfatados no permetilados enriquece concomitantemente para especies cargadas al mismo tiempo simplificar MS 2 patrones de fragmentación. También se presenta un protocolo integral para mejorar el análisis de glicanos O-ligados en gel. El protocolo de recuperación mejorada aumenta el glicano, aumenta la información estructural puede obtenerse a través de MS n análisis de glicanos permetilados, y mejora la sensibilidad del análisis sulfoglycomic aplicadas a glicoproteínas esenciales aislados de fuentes biológicas.
Este protocolo está diseñado para O-glicano ligado análisis de extractos de glicoproteína enteros o de una glicoproteína específica de interés resueltas por SDS-PAGE y se compone de tres procedimientos experimentales; A) gel de limpieza, B) en gel reductora β-eliminación y C) permethy glicanolación. El objetivo es obtener datos glycomic integrales O-ligados para glicoproteínas cosechadas a partir de fuentes primarias de interés biológico (Figura 1). Las glicoproteínas separadas por SDS-PAGE se visualizaron por tinción y bandas de interés se escindieron y la banda de gel resultante se corta en trozos pequeños. Las piezas de gel se destiñeron y se sometieron a lavados de acetato de etilo para eliminar los contaminantes de gel (Figura 2a). La liberación de glucanos se consigue mediante in-gel reductora β-eliminación (Figura 2B) y los glicanos liberados se permetiló. Acuoso-orgánico de extracción siguiente permetilación particiones cuantitativamente los glicanos aniónicos sulfatados lejos de glicanos neutros no sulfatados (Figura 2C). En-gel reductora β-eliminación acoplado a extracción acuosa-orgánica permite la caracterización de glicanos O-ligados y sulfoglycans liberados de pequeñas cantidades de glicoproteína separados por SDS-PAGE. La visión estratégica es summariZed en la Figura 1 y los detalles se muestran en la Figura 2. Además, una parte de las piezas de gel se lavaron destained y se puede utilizar para ID de proteínas mediante técnicas proteómicas estándar LC-MS / MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
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