Неферментативное, сыворотка-бесплатно культуры ткани из Pre-инвазивных поражений груди для самозарождения Mammospheres
Summary
Первичной культуры клеток с использованием интактных органоиды ткани обеспечивает систему модели, который имитирует многоклеточных микросреду в естественных условиях. Мы разработали модель первичной культуры груди эпителий тканей бессывороточной что увековечивает смешанные культуры клеток клоны и экспонаты дифференцированные морфологию, без нарушения ферментативной ткани. Грудь органоиды остаются жизнеспособными в течение> 6 месяцев.
Abstract
Карциномы протоков молочной железы на месте (DCIS), по определению, является распространение неопластических эпителиальных клеток в пределах от груди канала, не нарушая коллагеновый базальную мембрану. В то время как DCIS не является облигатным предшественником инвазивного рака молочной железы, молекулярные механизмы, и клеточные популяции, которые позволяют прогрессирование в инвазивный рак полностью не известны. Чтобы определить, если клетки-предшественники, способные вторжения существовал в клеточной популяции DCIS, мы разработали методику сбора и культивирования стерильной ткани молочной железы человека в момент операции, без нарушения ферментативной ткани.
Стерильный ткани молочной железы, содержащий протоков сегментов собирают из хирургическим путем ткани молочной железы после рутинной патологического исследования. Ткань, содержащая DCIS находится в богатых питательными веществами, содержащей антибиотик, свободной от сыворотки среде, и доставить в лабораторию для культивирования тканей. Ткань молочной железы является дальнейшее dissected изолировать кальцинированные участки. Несколько компонентов грудного ткани (органоидами) помещают в минимальном объеме бессывороточной среде в колбе со съемной крышкой и культивируют в увлажненной CO 2 инкубаторе. Эпителиальные и фибробластов клеточные популяции выйти из Органоид после 10 – 14 дней. Mammospheres самопроизвольно образуют на и вокруг эпителиального монослоя клеток. Конкретные клеточные популяции могут быть собраны непосредственно из колбы, не нарушая соседние клетки. Наша система неферментативное культуры ткани надежно показывает цитогенетически ненормальные, агрессивные клетки-предшественники из свежих поражений человека DCIS.
Introduction
Пролиферация эпителиальных клеток в пределах груди протоков и альвеол (раком протоков на месте), признается в качестве закономерной предшественником инвазивного протоков и очаговая рак молочной железы. Тем не менее, молекулярные механизмы и динамика популяции клеток, которые позволяют прогрессирование в инвазивный рак, плохо понимал. Выяснение механизмов выживания, используемые до инвазивных клеток карциномы молочной железы, или любой предварительно инвазивной опухоли, может выявить терапевтические стратегии для убийства, или даже предотвращения, предварительно инвазивных опухолей 1. Тем не менее, простые методы недорогие для функционально обучающихся человека предварительно инвазивных поражений не хватало. Хотя в пробирке монослой культуры трансформированных клеточных линий является признанным методом лабораторной, фенотип и генотип этих иммортализованных клеточных линий не может повторять молекулярную статус первичных человеческих опухолевых клетках 2. Кроме того, даже без онкогенными клеточной линии MCF-10A, который RecApitulates 3-D молочной архитектура железы, не позволяет адекватно представлять функциональную фенотип и молекулярные характеристики предварительно инвазивного поражения молочной отдельного пациента 3,4.
Чтобы определить, является ли стволовые, как опухолевые клетки, способные вторжения существовал в протоковой карциномы (DCIS) клеточной популяции, мы разработали методологию сбора и культивирования стерильной ткани молочной железы человека в момент операции (рисунок 1) 5. Наш бывший естественных груди система Органоид культура не зависит от перебоев ферментативной ткани, базальной мембраны экстракта матрицы, или истощения фибробластов, выделения и размножения mammosphere-клеток, образующих из свежих протоков молочной железы человека карциномы ткани 6-8. Наша новая система основана на принципе клеточной миграции потокового / 5. В различимые протоки молочной железы и окружающих стромы погружены в минимальном объеме бессывороточной питательной среды (просто еnough для покрытия фрагменты воздуховодов), чтобы максимизировать газообмен, с поверхности разреза канала воздействию культуральной среде, но ни в коем определенной ориентации в колбе (рис 1E-F). Эта система культуры позволяет клеткам мигрировать из канала и в / на аутологичных стромы и культуральной колбы. Питательная среда, дополненной только с фактор эпидермального роста (EGF), инсулин и антибиотиков, поддерживает рост популяций смешанных клеточных исходящих из Органоид. Тканевой культуральной колбы имеет съемную, многократно открывать и закрывать крышку, которая позволяет органоиды и / или клетки должны быть собраны без нарушения весь колбы или соседние органоиды, сохраняя при этом стерильную среду увлажненного.
Protocol
Representative Results
Discussion
Система культура описано здесь является новая модель генерации живущих предварительно инвазивных опухолевых клеток молочной железы для основных и трансляционных исследований. В прошлом, до прогрессирования злокачественной рак молочной железы, как правило, были изучены с использова…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана (1) Министерство обороны груди Программа исследований рака (US Army Medical Research Приобретение активность) награда # W81XVVH-10-1-0781 в LAL и VE, и (2) грант Сьюзен Г. Комен IR122224446 к Лал и VE. Поддержка патологии и ткани кассовым был любезно предоставлен Inova Fairfax патологоанатомического отделения, доктор Хасан Nayer, доктор Гита А. Менезес, и д-р Чарльз Bechert. Согласие пациента и образца по закупкам со знанием руководствуется Inova Fairfax Hospital клиническое исследование координаторов Холли Галлимор, Хизер Huryk, и Эмиль Камар.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
| 25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C. Preinvasive breast cancer. Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women’s Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D’amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
