Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres
Summary
Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant> 6 mois.
Abstract
Sein carcinome canalaire in situ (CCIS), par définition, est la prolifération des cellules épithéliales néoplasiques dans les limites de la conduite du sein, sans porter atteinte à la membrane basale de collagène. Bien CCIS est un précurseur non obligatoire pour les cancers du sein invasifs, les mécanismes moléculaires et les populations de cellules qui permettent la progression vers un cancer invasif ne sont pas complètement connus. Pour déterminer si les cellules souches capables d'invasion existaient au sein de la population de cellules CCIS, nous avons développé une méthodologie de collecte et de culture de tissu stérile maternel au moment de la chirurgie, sans perturbation enzymatique de tissu.
Tissu mammaire stérile contenant des segments canalaires est récolté à partir de tissu mammaire excisé chirurgicalement après examen pathologique de routine. Tissu contenant DCIS est placé en milieu riche en nutriments, contenant l'antibiotique, sans sérum, et transporté au laboratoire de culture de tissus. Le tissu mammaire est également dissected pour isoler les zones calcifiées. Morceaux de tissu du sein multiples (organites) sont placés dans un volume minimal de milieu sans sérum dans un flacon muni d'un couvercle amovible et cultivées dans un incubateur à CO2 humidifié. Populations de cellules épithéliales et fibroblastes émergent de la organoïde après 10 – 14 jours. Mammospheres former spontanément sur et autour de la monocouche de cellules épithéliales. Populations spécifiques de cellules peuvent être récoltées directement du ballon sans perturber les cellules voisines. Notre système de culture de tissu non-enzymatique révèle fiable cytogénétique anormaux, des cellules progénitrices invasives de lésions humaines fraîches de DCIS.
Introduction
La prolifération des cellules épithéliales dans les limites de canaux du sein et les alvéoles (carcinome canalaire in situ) est reconnu comme un précurseur obligatoire à canalaire infiltrant et le carcinome lobulaire. Néanmoins, les mécanismes moléculaires et la dynamique des populations de cellules qui permettent la progression vers un cancer invasif sont mal comprises. Élucider les mécanismes de survie utilisées par les cellules de carcinome du sein pré-invasives, ou toute tumeur pré-invasive, peut révéler des stratégies thérapeutiques pour le meurtre, voire d'empêcher, les tumeurs pré-invasives 1. Cependant, les méthodes simples et peu coûteuses pour l'étude fonctionnelle des lésions pré-invasives humaines ont fait défaut. Bien que la monocouche de culture in vitro de lignées de cellules transformées est une méthode de laboratoire établi, le phénotype et le génotype de ces lignées cellulaires immortalisées ne parvient pas à récapituler l'état moléculaire des cellules tumorales humaines primaires 2. En outre, même la lignée de cellules MCF-10A non-tumorigène, qui RecApitulates 3-D architecture de la glande mammaire, ne représente pas de manière adéquate le phénotype fonctionnel et caractéristiques moléculaires de la lésion du sein pré-invasive d'un patient individuel 3,4.
Pour déterminer si les cellules souches néoplasiques comme capables d'invasion existaient dans le carcinome canalaire in situ (CCIS) population de cellules, nous avons développé une méthodologie de collecte et de culture de tissu stérile maternel au moment de la chirurgie (Figure 1) 5. Notre ex vivo sein du système de culture organoïde ne dépend pas de perturbation enzymatique de tissu, matrice de membrane basale de l'extrait, ou l'appauvrissement des fibroblastes, pour l'isolement et la propagation de cellules formant mammosphere de frais canalaire du sein carcinome humain tissu 8.6. Notre nouveau système est basé sur le principe de la cellule de streaming / 5 migration. Les canaux du sein perceptibles, et le stroma environnant sont immergés dans un volume minimal de milieu nutritif sans sérum (juste enough à recouvrir les fragments de conduits) afin de maximiser l'échange de gaz, avec la surface de la gaine exposée au milieu de culture de coupure, mais pas dans une orientation spécifique dans le ballon (figure 1E-F). Ce système de culture de cellules permet de migrer hors de la gaine et dans / sur le stroma et ballon de culture autologue. Le milieu nutritif, complétée seulement par facteur de croissance épidermique (EGF), l'insuline et des antibiotiques, favorise la croissance de populations cellulaires mixtes issues de la organoïde. Le flacon de culture de tissu a une refermable couvercle amovible, qui permet aux organites et / ou des cellules qui doivent être récoltées, sans perturber le ballon ou voisins organites entiers, tout en maintenant un environnement stérile humidifié.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système de culture décrit ici constitue un nouveau modèle pour générer des cellules vivantes mammaires néoplasiques pré-invasives pour les études de base et de recherche translationnelle. Dans le passé, la progression du cancer du sein pré-malin a généralement été étudié en utilisant trois procédés différents. La première méthode est histopathologique et l'analyse génétique des échantillons humains congelés ou fixes microdisséquées 12-14. La deuxième méthode utilise des mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par (1) le ministère de la Défense Programme Cancer Research (Recherche Acquisition Activité US Army Medical) de prix # W81XVVH-10-1-0781 à LAL et VE, et (2) la subvention de la Fondation Susan G. Komen Breast IR122224446 Lal et VE. des services de pathologie et extrapolation de tissu a été gracieusement fournie par Inova Fairfax département de pathologie, le Dr Hassan Nayer, le Dr Geetha A. Menezes, et le Dr Charles Bechert. Le consentement du patient et la collecte des échantillons a été savamment guidés par l'hôpital Inova Fairfax coordonnateurs de recherche clinique de Holly Gallimore, Heather Huryk, et Emil Kamar.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
| 25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C. Preinvasive breast cancer. Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women’s Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D’amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
