Summary
ثقافة الخلية الأولية باستخدام organoids الأنسجة سليمة توفر نظام النموذج الذي يحاكي متعددة الخلايا المكروية في الجسم الحي. وضعنا الأساسي الأنسجة الطلائية الثدي نموذج ثقافة خالية من مصل أن يديم مختلطة الأنساب زراعة الخلايا والمعارض التشكل متباينة، دون انقطاع الأنسجة الأنزيمية. تبقى organoids الثدي القابل للتطبيق ل> 6 أشهر.
Abstract
الثدي سرطان الأقنية في الموقع (DCIS)، بحكم التعريف، هو انتشار الخلايا الظهارية الأورام ضمن حدود القناة الثدي، دون خرق الغشاء القاعدي كولاجيني. بينما DCIS هو السلائف غير تلزم لسرطانات الثدي الغازية، ليست معروفة تماما الآليات الجزيئية والسكان الخلية التي تسمح للتطور سرطان الغازية. لتحديد ما إذا كانت هناك خلايا السلف قادرة على الغزو بين السكان خلية DCIS، وضعنا منهجية لجمع وزراعة الأنسجة عقيمة الثدي البشري في وقت الجراحة، دون انقطاع الأنزيمي من الأنسجة.
يتم حصاد معقمة أنسجة الثدي تحتوي على شرائح من الأقنية استئصاله جراحيا نسيج الثدي بعد الفحص الروتيني المرضية. يتم وضع الأنسجة التي تحتوي على DCIS في المغذيات الغنية، التي تحتوي على المضادات الحيوية، المتوسطة مجانا المصل، ونقلها إلى مختبر زراعة الأنسجة. نسيج الثدي هي أكثر dissecteد لعزل المناطق متكلسة. توضع قطعة نسيج الثدي متعددة (organoids) في حجم الحد الأدنى من مصل المتوسطة مجانا في قارورة مع غطاء قابل للإزالة ومثقف في ترطيب CO 2 الحاضنة. السكان الخلايا الظهارية والخلايا الليفية الخروج من عضي وبعد 10 - 14 يوم. Mammospheres تشكل بشكل عفوي في وحول أحادي الطبقة الخلايا الظهارية. يمكن حصاده السكان خلية معينة مباشرة من القارورة دون تعطيل الخلايا المجاورة. لدينا غير الأنزيمية نظام زراعة الأنسجة يكشف موثوق cytogenetically غير طبيعية، وخلايا السلف الغازية من الآفات DCIS الإنسان العذبة.
Introduction
يتم الاعتراف انتشار الخلايا الظهارية في كنف قنوات الثدي والحويصلات الهوائية (سرطان الأقنية في الموقع) باعتبارها تمهيدا لإلزام الأقنية الغازية ومفصص سرطان الثدي. ومع ذلك، وغير مفهومة الآليات الجزيئية وديناميات السكان الخلية التي تسمح للتطور سرطان الغازية. توضيح الآليات التي تستخدمها بقاء خلايا سرطان الثدي قبل الغازية، أو أي ورم قبل الغازية، قد تكشف عن الاستراتيجيات العلاجية لقتله، أو حتى منع والأورام قبل الغازية 1. ومع ذلك، أساليب بسيطة منخفضة التكلفة لدراسة وظيفيا الآفات ما قبل الغازية الإنسان قد يفتقر. على الرغم من أن في المختبر ثقافة أحادي الطبقة من خطوط الخلايا تحولت هي طريقة المختبر المعمول بها، النمط الظاهري والنمط الجيني لهذه خطوط الخلايا خلد يفشل في ألخص الوضع الجزيئي للخلايا السرطانية البشرية الابتدائية 2. وعلاوة على ذلك، حتى خط الخلية MCF-10A غير مكون للأورام، الذي RECApitulates 3-D العمارة الغدة الثديية، فشل في تمثيل كاف النمط الظاهري الوظيفي والخصائص الجزيئية من قبل الآفة الغازية الثدي هذا المريض في 3،4.
لتحديد ما إذا كان وجود مثل الخلايا الجذعية الورمية قادرة على الغزو داخل سرطان الأقنية في الموقع (DCIS) السكان في خلية، وضعنا منهجية لجمع وزراعة الأنسجة عقيمة الثدي البشري في وقت الجراحة (الشكل 1) 5. لا تعتمد لدينا فيفو السابقين الثدي نظام الثقافة عضي على انقطاع الأنزيمي الأنسجة، والغشاء القاعدي استخراج مصفوفة، أو استنزاف الخلايا الليفية، لعزل ونشر الخلايا المكونة mammosphere جديدة من الأقنية سرطان الثدي البشرية الأنسجة 6-8. ويستند نظامنا الجديد على مبدأ خلية يتدفقون / 5 الهجرة. وغرقت القنوات الثدي اضحة، وسدى المحيطة بها في الحد الأدنى من حجم المصل خالية المتوسطة المغذيات (فقط الإلكترونيةnough لتغطية أجزاء القناة) لتحقيق أقصى قدر من تبادل الغازات، مع سطح قطع من القناة تتعرض لمستنبت، ولكن في أي اتجاه محدد في قارورة (الشكل 1E-F). هذا النظام يسمح ثقافة الخلايا تهاجر من القناة وإلى / على ذاتي سدى والثقافة قارورة. المتوسط المغذيات، على أن تستكمل إلا مع عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، الانسولين، والمضادات الحيوية، ويدعم نمو السكان الخلية المختلطة المنبثقة عن عضي. قارورة زراعة الأنسجة لديها قابل للنقل، اعادة اغلاقها باحكام الغطاء الذي يسمح للorganoids و / أو خلايا أن تحصد دون تعطيل القارورة أو المجاورة بأكمله organoids، مع الحفاظ على بيئة معقمة مرطب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع أنسجة الثدي الإنسان من المرضى المسجلين في دراسة بحثية، مع الموافقة المسبقة الخطية، بعد وزارة الدفاع، جامعة جورج ماسون، وبروتوكولات النظام الصحي Inova شركة المؤسسية مراجعة المجلس وافق.
1. إعداد المواد الغذائية الغنية المتوسطة مع عوامل النمو والمضادات الحيوية
- إعداد الحلول الأسهم من الأنسولين، وعامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، كبريتات كبريتات الستربتومايسين وجنتاميسين.
- إعادة الأنسولين في الماء المعقم تصفيتها إلى تركيز النهائي من 10 ملغ / مل. نضح 10 مل من نوع 1 كاشف المياه في الصف معقمة 10 مل الحقنة. إرفاق مرشح 0.22 ميكرون polyethersulfone إلى الحقنة. صرف المياه التي تمت تصفيتها العقيمة في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي.
- إضافة 10 مل من الماء المعقم تصفيتها إلى 100 ملغ قنينة من الأنسولين. خلط محتويات فترة وجيزة على خلاط دوامة. الحفاظ على قارورة الأنسولين على الجليد. الاستغناء عن 450 ميكرولتر من المحاليل الأسهم الأنسوليننشوئها في المسمى، أنابيب microcentrifuge العقيمة وتخزينها في -20 درجة مئوية. الحل الأسهم الأنسولين هو مستقر حتى تاريخ انتهاء الصلاحية على القارورة.
- تحضير محلول المخزون من عامل نمو البشرة (EGF): إضافة 500 ميكرولتر الماء المعقم إلى 500 ميكروغرام صندوق تعديل العولمة الأوروبي (الأسهم 1 ميكروغرام / ميكرولتر). خلط محتويات فترة وجيزة على خلاط دوامة. إبقاء قنينة صندوق تعديل العولمة الأوروبي على الجليد.
- إعداد محلول المخزون عمل صندوق تعديل العولمة الأوروبي: إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون صندوق تعديل العولمة الأوروبي إلى 900 ميكرولتر المتوسطة المغذيات (لن المخزون العامل هو 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر). خلط محتويات فترة وجيزة على خلاط دوامة. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من محلول المخزون يعمل صندوق تعديل العولمة الأوروبي في المسمى، أنابيب microcentrifuge العقيمة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: صندوق تعديل العولمة الأوروبي محلول المخزون (1 ميكروغرام / ميكرولتر) مستقر لمدة 1 سنة في -80 درجة مئوية. يعمل حل سهم (0.1 ميكروغرام / ميكرولتر) غير مستقر لمدة 2 أشهر في -80 درجة مئوية.
- إعداد محلول المخزون عمل صندوق تعديل العولمة الأوروبي: إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون صندوق تعديل العولمة الأوروبي إلى 900 ميكرولتر المتوسطة المغذيات (لن المخزون العامل هو 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر). خلط محتويات فترة وجيزة على خلاط دوامة. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من محلول المخزون يعمل صندوق تعديل العولمة الأوروبي في المسمى، أنابيب microcentrifuge العقيمة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تزن 40 ملغ من كبريتات الستربتومايسين على الميزان التحليلي. وضع الباحث ستربتومايسين سلفاتالزراعة العضوية معقمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 4 مل من المتوسط المغذيات. خلط محتويات فترة وجيزة على خلاط دوامة. يجب أن يكون الحل الوردي قليلا. تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء. محلول كبريتات الستربتومايسين مستقر لمدة 7 أيام.
- تزن 20 ملغ من كبريتات جنتاميسين على الميزان التحليلي. وضع كبريتات الجنتاميسين في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 2 مل من المتوسط المغذيات. خلط محتويات فترة وجيزة على خلاط دوامة. يجب أن يكون الحل الأصفر. تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء. محلول كبريتات الجنتاميسين مستقر لمدة 7 أيام.
- إعداد 200 مل دفعات اثنين من المغذيات المتوسطة تستكمل مع EGF البشري المؤتلف (10 نانوغرام / مل اضرب النهائي.)، الأنسولين (10 ميكروغرام / مل اضرب النهائي.)، كبريتات الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل اضرب النهائي.) وكبريتات جنتاميسين (20 ميكروغرام / مل اضرب النهائي).
- إضافة المتوسطة 200 مل المغذيات إلى قارورة فراغ مرشح مجهزة مرشح قارورة 0.2 ميكرون polyethersulfone وتلقي زجاجة 250 مل. إضافة 20 و# 181؛ الاسهم عمل ل صندوق تعديل العولمة الأوروبي، و 200 ميكرولتر الأنسولين الأسهم، 2 مل الأسهم ستربتومايسين سلفات، و 400 ميكرولتر الأسهم جنتاميسين سلفات إلى 200 مل من المتوسط المغذيات. نعلق قارورة مرشح للفراغ. تصفية المتوسط. تجاهل تصفية وتسمية قارورة بأنها "متوسطة غنية بالمغذيات". تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 14 يوما.
2. الأنسجة اقتناء وتربح
- في جناح التشغيل، والحفاظ على تقنية معقمة بعد شراء نسيج الثدي. وضع أنسجة الثدي في علبة معقمة وتغطي علبة مع غلاف بلاستيكي معقم.
- نقل الأنسجة في صينية مغطاة إلى الأشعة / علم الأمراض كما هو مطلوب من قبل مؤسستكم. لا تفتح الدرج. وتختلف الأوقات النقل داخل المؤسسات. الأنسجة يمكن أن تبقى قابلة للحياة في هذا علبة مغطاة في RT لمدة تصل إلى 45 دقيقة بعد الختان. ومع ذلك، سرعة تجهيز الأنسجة في المغذيات الغنية المتوسطة يوفر الظروف المثلى لثقافة عضي اللاحقة.
- تشريح الأنسجة الإجمالي لتحديد مجالات DCIS داخل أنسجة الثدي: استخدام قفازات معقمة، شفرات، المشارط، النسيج الأصباغ وسم، والخل أثناء تشريح الأنسجة للحفاظ على عقم الأنسجة.
- تنظيف منطقة العمل مع الايثانول 70٪ أو 1٪ التبييض. فتح قفازات معقمة ووضع المجمع قفاز على سطح العمل. ضع الداخلية العقيمة من القفازات المجمع مكشوفة. وضعت على قفازات معقمة.
- تنظيف سطح الحاوية عينة مع الايثانول 70٪. إزالة غلاف بلاستيكي من الحاوية عينة الأنسجة ووضع العينة على المجمع القفازات.
- وتراجع اثنين من القطن مسحات يميل إلى الأنسجة بمناسبة الصبغة. تطبيق الصبغة على سطح الأنسجة من قبل المتداول مسحات عبر سطح الأنسجة.
ملاحظة: كل قسم علم الأمراض لديها لون الصبغة / الأنسجة بروتوكول توجه موحد. هو المسمى الأنسجة مع صبغة لتوجيه الأنسجة فيما يتعلق بموقفها في المريض. ونشف الصبغة أورسمت على الأنسجة. لا صب الصبغة على الأنسجة. يمكن أن تتدفق الصبغة تسبب الصبغة لتشغيل / بالتنقيط في الشقوق الأنسجة وبالتالي الخلط بين التوجه هوامش الجراحية. يوفر التوجه الأنسجة الجراح والطبيب الشرعي مع معالم التشريحية لأ) وصف عينة الأنسجة، وب) تحديد مكان وجود هوامش الجراحية فيما يتعلق الورم. - يسكب الخل الأبيض المقطر (5٪ حامض الخليك) على منصات شاش معقمة. وصمة عار على النسيج مصبوغ مع الخل غارقة الشاش. التخلص من الشاش. ويستخدم الخل لإصلاح الأنسجة بمناسبة الأصباغ.
- قطع أنسجة الثدي إلى شرائح عمودية حوالي 5 مم. لا قطع كل الطريق من خلال الأنسجة (الشكل 2). ملاحظة / جس أنسجة للمناطق التكلس. تحديد الآفات DCIS من قبل شركاتهم مميزة، محاطة مظهر شاحب ضارب الى الحمرة، والحدود مطاطي أن يشعر شجاع (بسبب شويكات الكالسيوم).
ملاحظة: في بعض الحالات، يمكن للمناطق بثرة (تشبه بثرة) يكونينظر إليها على أنها بقع بيضاء، وتمثل المواد غير الحية من القطر الكبير الآفات DCIS. - قطع مناطق من DCIS / نسيج الثدي متكلسة، بما في ذلك كمية صغيرة من الأنسجة المحيطة الثدي. وضع أنسجة الثدي في أنبوب معقم 50 مل تحتوي على 20-30 مل من المغذيات الغنية المتوسطة التي أعدت في الخطوة 1.
- مزيج من الأنسجة والمتوسطة من خلال عكس بلطف الأنبوب عدة مرات. تجاهل المتوسطة وإضافة متوسطة جديدة. وضع الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة والمتوسطة في وعاء معزول ونقل الأنسجة إلى المختبر زراعة الأنسجة.
- تنظيف منطقة العمل مع الايثانول 70٪ أو 1٪ التبييض. فتح قفازات معقمة ووضع المجمع قفاز على سطح العمل. ضع الداخلية العقيمة من القفازات المجمع مكشوفة. وضعت على قفازات معقمة.
3. نسيج الثقافة
- العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، صب الأنسجة وكمية صغيرة من المواد الغذائية المتوسطة في طبق بتري معقمة. باستخدام مشرط معقم قطع بعيدا والتخلص من الأنسجة الليفية. قطع أنسجة الثدي إلى أجزاء (organoids) حوالي 3 ملم 2 (الشكل 1C-D). محاولة لقطع الأنسجة بحيث يكون لكل جهازOID يحتوي على شريحة واحدة على الأقل لاصق ملحوظ مع سدى المحيطة بها.
- فتح غطاء قارورة زراعة الأنسجة. استخدام ملاقط معقمة أو ملقط، ضع organoids في قارورة. إغلاق الغطاء. تجاهل طبق بتري.
- إضافة 11 مل من المصل خالية من المغذيات الغنية المتوسطة (المعد في الخطوة 1) إلى قارورة زراعة الأنسجة. إغلاق القارورة ودوامة القارورة بحيث يتم توزيع organoids والمتوسطة بشكل متساو عبر سطح القارورة (الشكل 1E-F).
- احتضان القارورة في 37 درجة مئوية في ترطيب 5.0٪ CO 2 جو لمدة 2 أيام. لا تتحرك القارورة خلال هذا الوقت.
- في يوم 2 بعد الحضانة، وإزالة قارورة من الحاضنة للتحقق من احتمال تلوث بكتيري / فطرية. تجنب المفاجئة والحركات الحادة، أو دوامات من القارورة. ضع قارورة على مرحلة مجهر مقلوب.
- مراقبة المتوسطة للبكتيريا، والخميرة، و / أو الفطريات. إذا لاحظت أي تلوث، والعودة القارورة إلى حاضنة للالوظيفةاليوم itional. إذا لاحظت التلوث، تجاهل قارورة ومحتوياتها في وعاء المناسبة.
- في يوم 3 بعد الحضانة، واستبدال المتوسطة مكيفة مع المتوسطة الطازجة.
- وضع 11 مل من المتوسط في أنبوب معقم عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. إزالة قارورة زراعة الأنسجة من الحاضنة. دون إزعاج organoids، وإزالة وتجاهل المتوسطة في القارورة باستخدام ماصة معقمة مصلية.
- باستخدام ماصة معقمة مصلية جديدة، إضافة 11 مل من متوسطة جديدة استعد مسبقا. تناوب بلطف القارورة جدا لتوزيع المتوسطة عبر سطح القارورة.
- احتضان القارورة في 37 درجة مئوية في ترطيب 5.0٪ CO 2 الغلاف الجوي.
4. صيانة تأسست عضي / الظهارية المستعمرات الخلية
- إعداد متوسطة جديدة كل 2 أسابيع واستبدال وسائل الإعلام في الثقافة قارورة الأنسجة 3 مرات في الأسبوع.
- وضع 11 مل من المتوسط في حاوية معقمة في 37° مئوية لمدة 20-30 دقيقة. إزالة قارورة من الحاضنة. باستخدام ماصة معقمة مصلية، وإزالة وتجاهل المتوسطة مكيفة من القارورة، والحرص على عدم تعكير صفو organoids.
- باستخدام ماصة معقمة مصلية جديدة، إضافة 11 مل من متوسطة جديدة استعد مسبقا. تناوب بلطف القارورة جدا لتوزيع المتوسطة عبر سطح القارورة. احتضان القارورة في 37 درجة مئوية في ترطيب 5.0٪ CO 2 الغلاف الجوي.
- وبعد 10 - 14 يوم في الثقافة، وإزالة أي قطع من الأنسجة في قارورة الثقافة ليست ملتصقة.
- خلايا الحصاد دوريا و / أو organoids من القارورة لنشر ثقافة جديدة في قوارير، لزرع طعم أجنبي، أو المظهري و / أو التحليل الجزيئي.
- إزالة قارورة زراعة الأنسجة من الحاضنة. رش القارورة مع الايثانول 70٪. تمحو الإيثانول الزائد على القارورة مع منشفة ورقية نظيفة التي تم رشها مع الايثانول 70٪.
- نشر عضوي الشكل: <OL>
- فتح غطاء القارورة ووضع غطاء الوجه المتابعة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. تحت التصور المجهرية، حدد موقع عضي (ق) ليتم حصادها. استخدام ملاقط معقمة أو ملقط لالبيك اب وعضي.
- لنشر ثقافة عضي في قارورة جديدة، ضع عضي في قارورة جديدة. إضافة 11 مل الطازجة والمتوسطة الدافئة. احتضان عند 37 درجة مئوية، في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي كما هو موضح في الخطوات 3.3 - 3.6.3. استبدال مستنبت الخلايا في نسيج الثقافة قارورة ثلاث مرات في الأسبوع.
- حصاد الخلايا:
- تحت vixualization المجهرية مباشرة، كشط بلطف ونضح خلايا وmammospheres باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع نصائح ماصة معقمة المتاح. نضح الخلايا والوسط المحيط. الاستغناء الخلايا / متوسطة إلى أنبوب microcentrifuge العقيمة.
- تدور الخلايا لفترة وجيزة في-مصغرة الطرد المركزي في 12100 x ج لمدة 5 ثانية. إزالة وتجاهل المتوسطة. <OL>
- لتحليل الحمض النووي، وتجميد فورا بيليه الخلية على الثلج الجاف، في حجم صغير من المتوسط (10 ميكرولتر)، مع تخزين طويل المدى في -80 درجة مئوية.
- لتحليل البروتين، ليز الخلايا في 10 ميكرولتر من 8 M اليوريا لقياس الطيف الكتلي أو 2X SDS-تريس جليكاين عازلة للغرب النشاف / عكس المرحلة ميكروأرس البروتين. بدلا من ذلك، وتدور الخلايا في cytocentrifuge لجعل مسحات خلية للتحليل المناعى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سير العمل لشراء وزرع معقمة الأقنية الثدي سرطان الأنسجة في الموقع
ويحتفظ العقم أنسجة الثدي من غرفة العمليات إلى مختبر زراعة الخلايا عن طريق تغييرات طفيفة في نموذجي سير العمل علم الأمراض في المستشفى (الشكل 1). ويتم نقل الأنسجة في حاوية معقمة مع غطاء فيلم من البلاستيك الذي يسمح بتقييم إشعاعي مع الحفاظ على عقم الأنسجة. تتم معالجة الأنسجة الإجمالي لعينة استئصال الورم أو استئصال الثدي الثدي مع قفازات معقمة، شفرات، والأنسجة بمناسبة الأصباغ. الإجمالي ظهور المورفولوجي من الأقنية الثدي سرطان في الموقع يشبه مناطق شاحبة، مرتفعة قليلا مع / نسيج متين شجاع، وتحيط بها المحمر / الأنسجة المطاطية الصفراء. مجالات تضخم الأقنية وDCIS قد يشعر "شجاع" وشركة بسبب تكلسات. هذه المناطق من نسيج الثدي غالبا ما تظهر تان أو لون مختلف قليلا من أنسجة الثدي المحيطة بها. ومع ذلك، ADH جوفقط يمكن تمييزها بعد جمع الأنسجة ومراجعة مرضية من أقسام الأنسجة الملون. لا تزال قابلة للحياة أنسجة الثدي عن طريق غمر النسيج و / أو organoids الأقنية في المصل خالية المتوسطة المغذيات تستكمل مع EGF البشري المؤتلف (10 نانوغرام / مل)، الأنسولين (10 ميكروغرام / مل)، كبريتات الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، وجنتاميسين سلفات (20 ميكروغرام / مل) 5. قوارير زراعة الخلايا مع أغطية قابلة للإزالة / اعادة اغلاقها باحكام تسمح حصاد الدوري من خلايا / organoids (الشكل 1E-F). نشر هذا النموذج بنجاح آفات الثدي ما قبل الغازية الإنسان من أكثر من 20 مريضا مصابين شاذة تضخم الأقنية (ن = 2) وسرطان الأقنية في الموقع (ن = 18).
تشكيل mammosphere عفوية في المختبر وفي الجسم الحي
Mammospheres والهياكل 3-D نشأت عفويا من متعددة ومستقلة DCIS قناة شظايا الأنسجة البشرية من مختلف المرضى تشخيص فرط الأقنية شاذةplasia أو سرطان الأقنية في الموقع (الشكل 3 و 4) 5،9. لم يتم تنفيذ تعطيل الأنزيمية للأنسجة الثدي قبل زراعة الأنسجة، مما أدى إلى نوع من الخلايا ثقافة مختلطة. كان مطلوبا ولا مصل، المصفوفات استخراج الغشاء القاعدي، ولا هلام تشبه لتشكيل mammosphere العفوي (الشكل 4). ولدت mammospheres الأورام الثديية طعم أجنبي في نموذج الفأر NOD / SCID مع نمط النمو نفسه كما ان من سرطان الغازية (الشكل 5) 5. وتظهر هذه النتائج أن الخلايا الاصلية مع الغازية المحتملة مسبقا موجودة داخل الثدي البشري DCIS القناة ولكن على ما يبدو تقام في الاختيار من الأقنية المتخصصة ويمكن أقنع في الظهور في الثقافة عضي. هذه الخلايا تشكل فئة جديدة من خلايا الثدي مثل الجذعية الموجودة قبل مظهر علني من النمط الظاهري 5،9،10 الغازية.
تأكيد الظهارية المستمدة mammospheres وxenografTS
وقد أكدت mammospheres وxenografts المستمدة من mammospheres بواسطة المناعي وجود أصول الظهارية. جزيء التصاق الخلايا الظهارية (EpCAM) هو بروتين سكري غشاء أعرب عن الخلايا الظهارية 11. أظهر المناعي مع الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة لEpCAM رد الفعل البشري (الخضراء) وصمة عار النووية (دابي والأزرق) خلايا إيجابية EpCAM في mammospheres في الثقافة (الشكل 6A) ومركز طعم أجنبي NOD / SCID (الشكل 6B).
التحقق من حدود الغشاء القاعدي سليمة
وmammosphere تشكيل، وقد استمدت الخلايا الظهارية الأورام في هذا النظام الثقافة من آفات الثدي ما قبل الغازية التي كانت تخلو من غزو صريح أو غزو مكروي، كما تم التحقق منها من خلال تحليل باثولوجي مستقل تحت مستوى التشخيص النسيجي الرعاية. هياكل عضي متعددة من نفس المريض ولدت mammosphere لالمستعمرات مينغ الذي أثبت أنه مكون للأورام. بالإضافة إلى ذلك، الفحص النسيجية من الأنسجة المستخدمة للثقافة عضي كشف الآفات ينترادوكتال متموجة مع حدود الغشاء القاعدي سليمة (7B الشكل) 5. وبالتالي فإنه يمكن استنتاج أن mammospheres عفوية تشكلت في هذا النظام ثقافة تستمد فقط من المناطق الأورام قبل الغازية وليست نتاج المناطق النادرة من غزو مكروي 5.
الشكل 1. سير العمل للحفاظ على عقم الأنسجة أثناء التصوير الإشعاعي والإجمالي تشريح الأنسجة. (A) في جناح التشغيل، يتم وضع نسيج الثدي (استئصال الورم عينة معروضة) في علبة معقمة ومغطاة التفاف البلاستيك العقيمة. الأنسجة يمكن تصويرها مباشرة في علبة من البلاستيك. (ب) الأنسجة الاطلاق لتحديد مجالات DCIS. ورسمت تستخدم مرة واحدة فقط التوجه النسيج الأصباغ على سطح الأنسجة باستخدام القطن المعقم مسحات الرؤوس. يسكب الخل الأبيض المقطر المنزلية مباشرة على الأنسجة ونشف مع شاش معقم القطن. ويتم نقل (C & D) أنسجة الثدي إلى مختبر زراعة الأنسجة في المغذيات الغنية المتوسطة تستكمل مع المضادات الحيوية. تشريح الأنسجة، لعزل مناطق DCIS، يتم تنفيذ استخدام قفازات معقمة وشفرات / المشارط / مقص. يتم قطع الأنسجة DCIS في organoids متعددة للثقافة. (E & F) في المختبر ثقافة organoids الثدي. يتم وضع الأنسجة DCIS الإنسان مباشرة في قوارير زراعة الأنسجة مع أغطية قابلة للإزالة، دون الهضم الأنزيمي مسبق من الأنسجة. وهناك كمية صغيرة من المصل خالية مستنبت تستكمل مع عامل نمو البشرة والانسولين يدعم نمو الخلايا مع الحفاظ على واجهة الهواء السائل حول عضي.6fig1highres.jpg "الهدف =" _ فارغا "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. توضيحات من معالجة الأنسجة الإجمالي لسرطان الثدي DCIS الأنسجة. يتم قطع استئصال الورم أو استئصال الثدي الأنسجة إلى أقسام رقيقة تشريح الأنسجة رأسيا دون أن يقطع كل الطريق من خلال عينة من قبل. وغالبا ما يشار إلى هذه الطريقة تشريح باسم "تقنية رغيف الخبز" منذ الأنسجة قطع تشبه رغيف الخبز. يتم قطع المنطقة (ق) يشتبه في احتوائها على DCIS من وشرائح لتصبح 2 - 3 مم شرائح لعلم الأمراض التشخيصي والثقافة عضي.
الرقم 3. نوع من الخلايا المختلطة الثقافةيحتفظ ممثل في السكان الخلية الحية. (A) صورة المرحلة النقيض من ثقافة الخلية المختلطة الناتجة عن سرطان الثدي DCIS الآفات على مدى 11 أسبوعا (4X التكبير). (B & C) في المختبر عضي زراعة بنجاح نشر DCIS اشتقاق الخلايا الظهارية مع نمو مستقل مرسى، تعرف بأنها زراعة التصاعدي والتوسع mammospheres ومفصص، تشكيلات تشبه القناة 3-D، في المتوسط مجانا المصل تستكمل مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي، الانسولين، ستربتومايسين وجنتاميسين (10X التكبير). (D) مثال mammosphere تشكلت بعد 11 أسابيع في الثقافة (40X التكبير). يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. عفويةتشكيل mammospheres في المصل ثقافة عضي الحرة. إن تشكيل mammosphere المثال التالي 33 يوما للثقافة (10X التكبير، 20X أقحم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. NOD / SCID نموذج الفأر طعم أجنبي. Xenografts تم إنشاؤها عن طريق حقن الخلايا الظهارية المستمدة من مريض مصاب DCIS (الماوس اليمين سادة الدهون الثدي) أو من مريض مصاب الغازية DCIS (الماوس الأيسر الثديية سادة الدهون). كشفت Xenografts المستمدة من كلا النقي DCIS والغازية DCIS نمط نمو مماثل ومعدل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من رشخصية له.
وأكدت الرقم 6. Mammospheres أن تكون من أصل الظهارية. المناعي مع مكافحة EpCAM مترافق إلى FITC كانت تستخدم لتأكيد أصل الظهارية من mammospheres وxenografts الماوس الناتجة عن مجاري الثدي تحتوي على DCIS. (A) خلايا إيجابية، EpCAM FITC (الزائفة اللون الأخضر، 488 نانومتر) وشوهد فقط في mammospheres من مزارع الخلايا المختلطة المنبثقة عن organoids الثدي (دابي (الزائفة اللون الأزرق، 408 نانومتر) وصمة عار النووية). (ب) في الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين أقسام الأنسجة الفأر طعم أجنبي، EpCAM إيجابية تم الكشف عن خلايا فقط في وسط القسم الورم طعم أجنبي. (20X التكبير) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا فيقوإعادة.
ويحيط الرقم 7. الكولاجين IV المناعية تكشف الأغشية الطابق السفلي سليمة المحيطة القنوات. القنوات الثدي العادية (A) من خلال الأغشية الطابق السفلي سليمة المخصب في الكولاجين الرابع (diaminobenzidine = تلطيخ البني). بعد ثقافة عضي، يحتوي نسيج الثدي أيضا الأغشية الطابق السفلي سليمة مؤكدا أن mammospheres مستمدة من مجالات DCIS وليس من سرطان الغازية (الكولاجين الرابع المناعية، لوحة والتكبير 4X، 10X لوحة ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام الثقافة الموصوفة هنا يشكل نموذجا جديدا لتوليد الخلايا الحية الثدي الأورام قبل الغازية للدراسات والبحوث الأساسية ومتعدية. في الماضي، وعادة ما تتم دراسته قبل خبيث تطور سرطان الثدي باستخدام ثلاث طرق مختلفة. الأسلوب الأول هو النسيجية والتحليل الجيني للmicrodissected المجمدة أو الثابتة العينات البشرية 12-14. يستخدم الأسلوب الثاني نماذج الماوس التي تحتوي على العقيدات السنخية (آفات HAN) المفرطة التصنع التي يعتقد أن تكون مشابهة لآفات الثدي ما قبل الغازية الإنسان 15. يستخدم تأسيس النموذج الثالث خطوط الخلايا سرطان الثدي مثل sublines MCF7 (MCF10A) التي لديها DCIS متباينة جدا مثل التشكل 3،4. على الرغم من أن هذه النماذج الثلاثة قد قدمت أدلة الجزيئية لتطور سرطان الثدي، فإن أيا من هذه الأساليب قادرة على تقييم إمكانات الخبيثة أو النمط الظاهري الجزيئي في آفة هذا المريض (ق). Histopathلا يوفر تحليل ologic المعلومات حول النمط الظاهري وظيفية من الخلايا في آفات ما قبل الغازية. نموذج الفأر من تطور سرطان الثدي قد لا تعكس بدقة histomorphology وتنوع البشري تضخم الأقنية غير نمطية، وسرطان مفصص في الموقع، وسرطان الأقنية في الموقع 16-18. وعلاوة على ذلك، المكروية اللحمية وترسب مصفوفة خارج الخلية المحيطة الماوس الآفات السلائف مختلفة بشكل ملحوظ عن نظيره البشري 16. يمكن عفوية الآفات السلائف الفئران تظهر مستوى منخفض جدا من التقدم إلى الغزو والانبثاث. الطريقة الثالثة، خطوط خلايا مستنبتة، يمكن أن توفر المعلومات المظهرية وظيفية إلا إذا زرعها في يستضيف المناعة قمعت 3،4. بالإضافة إلى تشوهات وراثية من خط الخلية passaged طويلة قد لا تمثل عفوية تطور سرطان الثدي في البشر 2. أخيرا، ثبت أيضا أن الأورام كل مريضلديها مزيج فريد من تشوهات جينية وراثية والتي تدفع معدل النمو، دولة متباينة، والتقدم إلى الغزو والانبثاث 13،14،17. آفات ما قبل الإنسان الغازية هي متعددة البؤر وغير متجانسة في تركيبها الخلية وhistomorphology. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال الخبيثة بيولوجية غير معروفة لآفة هذا المريض ما قبل الغازية.
لدينا طريقة زراعة الأنسجة الابتدائية يتغلب على أوجه القصور في نماذج سابقة من سرطان الثدي الغازية قبل الإنسان، ويوفر المزايا التالية: 1) يدعم نظام الثقافة عضوي الشكل نمو السكان الخلية الأورام المكروية داخل أنسجة الأم أن تنمو وتولد mammospheres التي سوف تنتج بشكل عفوي الأورام الغازية في نماذج الماوس طعم أجنبي. الخلايا تمثل النمط الجيني والنمط الظاهري للمريض، وبالتالي توفر المعلومات عن العلاج شخصية، أو التشخيص الفردي. 2) وعضوي الشكل للصيانة نظام الثقافةains في القطعان المحلية الخلوية ويوفر وسيلة لزراعة الخلايا الظهارية غير الخبيثة، خلايا انسجة والخلايا المناعية الموجودة أصلا في نسيج الثدي الابتدائية، وحملت في الثقافة داخل عضي. انخفاض حجم وسائل الإعلام في نظام الثقافة يدعم التبادل الأكسجين تشجيع تشكيل عفوية mammosphere وقناة متباينة والحويصلات الهوائية مثل الهياكل دون الحاجة إلى السقالات اصطناعية ثلاثة الأبعاد. 3) ثقافة الخلية الأولية هي خالية من التعديلات واختيار الناتجة عن التفكك الأنزيمية أو التعديل الوراثي الخارجية. وعلاوة على ذلك، فإن متوسط المغذيات هو منخفضة التكلفة وسهلة التحضير. 4) ويمكن إجراء التحليل الجزيئي والجيني على السكان خلية معينة و / أو organoids من الثقافة في نقاط مختلفة في الوقت المناسب دون تعطيل ثقافة بأكملها. 5) يسمح نظام الثقافة عضوي الشكل النمو، مورفولوجيا متباينة وخلية خلية التفاعلات بين السكان الخلية الأصلية التي يمكن أندراستها قبل وبعد إدخال العوامل العلاجية في وسائل الإعلام الثقافة.
على الرغم من أن زراعة الأنسجة الأولية لها مزايا معينة، فإنه لا يخلو من القيود. ثقافة عضي تدعم نمو الخلايا الثقافات المختلطة، دون فرط من أي نوع خلية واحدة. ومع ذلك، فإن نسبة محددة من أنواع الخلايا لا يمكن السيطرة عليها، وبالتالي قد لا ألخص النسب الخلوية الدقيقة الموجودة في الجسم الحي. عضي زراعة ناجحة يتطلب جمع ومعالجة الأنسجة عقيمة، وكلاهما ليسا الإجراءات الروتينية في كثير من مختبرات علم الأمراض في المستشفى المجتمع. التواصل الجيد بين الباحثين السريرية، وموظفي العمليات الجراحية، وأمراض الموظفين ضرورية للحفاظ على عينة العقم ضمن السلسلة المتصلة الحلقات من الرعاية للمرضى.
وهناك حد آخر للثقافة عضي هو تأثير التحتية الحزم على النمط الظاهري الخلوية والتعبير الجيني 16،19. تمايز الخلايا الجذعية في الثقافةيمكن أن يسببها إضافة المحتوية على مصل المتوسطة أو قد يكون نتيجة لفترة طويلة في الثقافة. تم الإبقاء على النمط الظاهري مثل الجذعية بعد عدة أشهر في هذا غير الأنزيمية، وخالية من مصل نظام الثقافة عضوي الشكل 5. ومع ذلك، في مرحلة ما من الوقت، والخلايا قد تفرق والتي يمكن رؤيتها شكليا - الخلايا تصبح أصغر حجما وأكثر كثافة، وتفشل في تشكيل mammospheres. لتجنب المشاكل المحتملة مع التغيرات في النمط الظاهري الخلايا مع مرور الوقت، والتجارب الجزيئية، مثل transfections أو هدم المقايسات، يجب أن يتم تنفيذ الثقافات مع الشباب وليس مع الثقافات القديمة (أكثر من 6 أشهر).
مفاتيح الثقافة عضي ناجحة تستخدم حجم مناسب من المتوسط في قارورة الثقافة، والسماح في الوقت organoids التمسك قارورة زراعة الأنسجة. متوسطة الزائد في نشر حدود قارورة الأوكسجين، مما يعوق تشكيل mammosphere. في أول 3 - 7 أيام من زراعة الأنسجة حاسمة لorganoids لنعلق على تيسمقاضاة الثقافة قارورة. بشكل عام، إذا لم تعلق على عضي بعد يوم 14، من المرجح لا تحتوي على أي أجزاء الأقنية DCIS قابلة للحياة ولن تصبح ملتصقة. يجب إزالة Organoids التي لم يتم متمسكا بعد يوم 14 من الثقافة. عدم وجود قنوات قابلة للحياة الثدي DCIS يمكن التحقق الثقافة التالية عن طريق تحديد عضي في 10٪ من الفورمالين ومعالجة الأنسجة إلى كتل البارافين لتلطيخ الأنسجة والتقييم المجهري.
لدينا غير الأنزيمية، نتائج نظام ثقافة خالية من مصل تدعم الفرضية القائلة بأن الخلايا الورمية الشاذة وراثيا مقدمة مع إمكانية الغازية موجودة داخل مسبقا الغازية آفات الثدي البشري 5،9،20. هذا الاستنتاج هو تمشيا مع الأعمال السابقة للSgroi آخرون، الذي أجرى التحليل الجيني لسرطان الثدي البشري آفات ما قبل الغازية وDamonte وآخرون الذين درسوا داخل الظهاري الأورام الثديية ثمرة (مينو) نموذج الفئران من تطور سرطان الثدي 12،14 21. توجي تؤخذذر مع استنتاجات الآخرين، نموذج ثقافتنا للمريض الآفات ما قبل الغازية يدعم مفهوم النمط الظاهري عدوانية من سرطان الثدي الغازية المريض قد يكون إلى حد كبير محددة مسبقا في مرحلة ما قبل الغازية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل (1) وزارة الدفاع برنامج أبحاث السرطان (US جيش البحوث الطبية اقتناء آخر) جائزة # W81XVVH-10-1-0781 لLAL وهاء، و (2) منحة مؤسسة سوزان جي كومن الثدي IR122224446 للال وVE. وقدم الدعم علم الأمراض والأنسجة الإجمال تفضلت وزارة Inova شركة فيرفاكس علم الأمراض الدكتور حسن ناير، الدكتور غيثا A. مينيزيس، والدكتور تشارلز Bechert. واسترشد موافقة المريض والمشتريات عينة بخبرة من قبل مستشفى Inova شركة فيرفاكس منسقي البحوث السريرية هولي غاليمور، هيذر Huryk، وإميل قمر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C.
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
