Ikke-enzymatisk, Serumfrit Tissue Culture of Pre-invasive brystlæsioner til spontane generation af Mammospheres
Summary
Primær cellekultur anvendelse af intakte væv organoids tilvejebringer en model, der efterligner den flercellede in vivo mikromiljø. Vi udviklede en serum-frit primær brystepitel vævskultur model, der foreviger blandede cellekultur slægter og udstillinger differentierede morfologi, uden enzymatisk vævssprængning. Breast organoids forbliver levedygtige i> 6 måneder.
Abstract
Breast duktalt carcinoma in situ (DCIS), per definition, er proliferation af neoplastiske epitelceller inden for rammerne af brystet kanalen, uden at bryde kollagenøse basalmembran. Mens DCIS er en ikke-obligat forløber for invasiv brystcancer, er de molekylære mekanismer og cellepopulationer, der tillader progression til invasiv cancer ikke helt kendt. At afgøre, om progenitorceller i stand til invasion eksisterede inden for DCIS cellepopulation, har vi udviklet en metode til indsamling og dyrkning sterilt humant brystvæv på tidspunktet for kirurgi, uden enzymatisk afbrydelse af væv.
Steril brystvæv indeholdende duktale segmenter høstes fra kirurgisk udskåret brystvæv efter rutinemæssig patologisk undersøgelse. Væv indeholdende DCIS er placeret i næringsrige, antibiotika-holdige, serumfrit medium, og transporteres til vævskulturlaboratorium. Brystvævet er yderligere dissected at isolere de forkalkede områder. Flere brystvæv stykker (organoids) er anbragt i et minimalt volumen af serumfrit medium i en kolbe med et aftageligt låg og dyrket i en befugtet CO2-inkubator. Epiteliale og fibroblast cellepopulationer dukke op fra organoide efter 10-14 dage. Mammospheres danner spontant på og omkring epitelcelle monolag. Specifikke cellepopulationer kan høstes direkte fra kolben uden at forstyrre naboceller. Vores ikke-enzymatisk vævskultursystem pålideligt afslører cytogenetisk unormale, invasive progenitorceller fra friske humane DCIS læsioner.
Introduction
Proliferation af epitelceller inden for rammerne af bryst kanaler og alveoler (duktalt carcinoma in situ) er anerkendt som en obligat forløber for invasiv duktalt og luftrør bryst carcinom. Ikke desto mindre er de molekylære mekanismer og cellepopulation dynamik, der tillader progression til invasiv cancer dårligt forstået. Belyse overlevelse mekanismer, der anvendes ved præ-invasive brystcarcinomaceller eller enhver pre-invasiv tumor, kan afsløre terapeutiske strategier til at dræbe, eller endog forhindre, præ-invasive neoplasmer 1. Imidlertid har enkle og billige metoder til funktionelt studerer humane præ-invasive læsioner har manglet. Selv om in vitro monolagskultur af transformerede cellelinier er en etableret laboratoriemetode, fænotype og genotype af disse immortaliserede cellelinjer ikke rekapitulere den molekylære status af primære humane tumorceller 2. Selv ikke-tumorigene MCF-10A-cellelinie, som recapitulates 3-D brystkirtel arkitektur, ikke i tilstrækkelig grad repræsenterer den funktionelle fænotype og molekylære karakteristika af en enkelte patients præ-invasive brystlæsion 3,4.
At afgøre, om stamceller-lignende neoplastiske celler i stand til invasion eksisterede inden duktalt carcinom in situ (DCIS) cellepopulation, har vi udviklet en metode til indsamling og dyrkning sterilt humant brystvæv på tidspunktet for kirurgi (figur 1) 5. Vores ex vivo bryst organoide dyrkningssystem ikke stole på enzymatisk vævssprængning, basalmembran ekstrakt matrix eller fibroblast ozonlaget, til isolering og plantemateriale mammosphere-dannende celler fra frisk bryst duktalt human carcinom væv 6-8. Vores nye system er baseret på princippet om celle streaming / migration 5. De mærkbare bryst kanaler, og de omkringliggende stroma er nedsænket i et minimalt volumen af serum-frit næringsstof medium (bare enough at dække kanal- fragmenter) for at maksimere gasudveksling med snitfladen af kanalen udsættes til dyrkningsmediet, men ingen specifik orientering i kolben (figur 1E-F). Dette dyrkningssystem tillader celler at migrere ud af kanalen og ind i / på autologe stroma og dyrkningskolbe. Næringsmediet, kun suppleres med epidermal vækstfaktor (EGF), insulin og antibiotika, understøtter vækst af blandede cellepopulationer hidrørende fra organoide. Vævsdyrkningskolben har en aftagelig, genlukkelig låg, der gør det muligt for organoids og / eller celler, der skal høstes uden at forstyrre hele kolbe eller nærliggende organoids, og samtidig opretholde et sterilt fugtigt miljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kulturen heri beskrevne udgør en ny model til at generere levende præ-invasive neoplastiske brystceller for basale og translationelle forskningsundersøgelser. Tidligere har præmaligne brystkræft progression typisk blevet undersøgt under anvendelse af tre forskellige metoder. Den første metode er det histopatologiske og genetisk analyse af Mikrodissekterede frosne eller fikserede humane prøver 12-14. Den anden metode udnytter musemodeller, der indeholder hyperplastiske alveolære knuder (HAN) læsioner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af (1) Department of Defense Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Activity) award # W81XVVH-10-1-0781 til LAL og VE, og (2) den Susan G. Komen Foundation tilskud IR122224446 på Lal og VE. Patologi support og væv opregning blev venligst stillet til rådighed af Inova Fairfax Pathology Department, Dr. Hassan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, og Dr. Charles Bechert. Patient samtykke og prøve indkøb sagkyndigt blev styret af Inova Fairfax Hospital klinisk forsknings koordinatorer Holly Gallimore, Heather Huryk, og Emil Kamar.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
| 25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C. Preinvasive breast cancer. Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women’s Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D’amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
