비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화
Summary
손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids>는 6 개월 가능한 남아있다.
Abstract
동일계 (DCIS)의 유방 유관 암종, 정의에 의해, 아교질 기저막을 위반하지 않고, 유방 덕트의 범위 내에서 종양의 상피 세포의 증식이다. DCIS는 침습적 유방암에 비 의무적 인 전구체이지만, 침습적 암의 진행을 허용하는 분자 메커니즘 및 세포 인구는 완전히 알려져 있지 않다. 침공 할 수있는 전구 세포가 DCIS 세포 인구 내에서 존재 여부를 확인하기 위해, 우리는 조직의 효소 중단하지 않고, 수술시 무균 인간의 유방 조직을 수집 및 배양 방법을 개발했다.
유관 분야를 포함하는 무균 유방 조직은 일상 병리 검사 다음과 같은 수술 적 절제 유방 조직에서 수확된다. DCIS 함유 조직은 조직 배양 실험실 풍부한 영양소, 항생제 – 함유, 무 혈청 배지에 넣고, 반송된다. 유방 조직은 더 dissecte입니다d는 석회화 된 영역을 분리한다. 다중 유방 조직 조각 (organoids)는 가습 CO 2 인큐베이터에서 이동식 뚜껑과 함께 배양 플라스크에서 무 혈청 배지의 최소 부피에 배치된다. 14 일 – 상피 세포와 섬유 아세포 세포 인구 10 후 organoid에서 등장. 자연에 형성 상피 세포 단층 주변 Mammospheres. 특정 세포 집단은 인접 셀에 영향을주지 않고 플라스크에서 직접 수확 할 수 있습니다. 우리의 비 효소 조직 배양 시스템은 안정적으로 신선한 인간 DCIS 병변에서 세포 유전 학적 이상, 침습성 전구 세포를 보여준다.
Introduction
유방 덕트 및 폐포 (현장에서 유관 암)의 범위 내에서 상피 세포의 증식은 침윤성 및 소엽 유방암에 대한 의무적 인 전구체로 인식되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 침윤성 암으로의 진행을 허용하는 분자 메커니즘 및 세포 집단 역학은 제대로 이해된다. 사전 침윤성 유방암 세포, 또는 임의의 미리 침습적 종양에서 사용 생존 메커니즘을 해명하기 죽이고, 심지어 사전 침습적 종양 1 방지용 치료 전략을 밝힐 수있다. 그러나, 기능적으로 공부 인간의 사전 침입 병변에 대한 간단한 저가의 방법이 결여되어있다. 형질 전환 된 세포주의 생체 외 단층 배양 확립 된 실험에있어서, 이러한 불멸화 세포주의 표현형과 유전자형이지만 일차 인간 종양 세포 (2)의 분자 상태를 요점을 되풀이하지 못한다. 또한, 심지어 비 – 발암 MCF-10A 세포주 어느 RECApitulates 3-D 유선 아키텍처는 적절하게 기능 표현형과 개별 환자의 사전 침습 유방 병변 3,4의 분자 특성을 표현하기 위해 실패합니다.
침공 할 수있는 줄기 같은 종양 세포가 현장 (DCIS) 세포 인구의 유관 암에서 존재 여부를 확인하기 위해, 우리는 (그림 1) (5) 수집 및 수술시 무균 인간의 유방 조직을 배양하기위한 방법론을 개발했다. 우리의 생체 가슴 organoid 문화 시스템은 분리하고 신선한 인간의 유방 유관 암 조직 6-8에서 mammosphere 형성 세포를 전파하기위한, 효소 조직 중단, 기저막 추출물 매트릭스, 또는 섬유 아세포 고갈에 의존하지 않습니다. 우리의 새로운 시스템은 셀 스트리밍 / 이주 (5)의 원리에 기초한다. 식별 유방 덕트 및 주변 기질 무 혈청 영양 배지 (단지 예 최소 체적에 빠져들배지에 노출 덕트의 절단면과, 가스 교환을 최대화하지만 플라스크 (도 1E-F)의 구체적인 배향하는) 덕트 단편을 덮도록, 계속하지. 이 문화 시스템은 세포가자가 기질과 문화 플라스크 위에 덕트에서 그리고 /로 마이그레이션 할 수 있습니다. 단지 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, 항생제로 보충 영양 배지는 organoid에서 냄새가 나는데 혼합 세포 집단의 성장을 지원합니다. 조직 배양 플라스크를 멸균 습한 환경을 유지하면서, organoids 및 / 또는 세포 전체 플라스크 또는 이웃 organoids 중단없이 수확 할 수 있도록 분리형 재 밀봉 가능한 뚜껑을 갖는다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기재된 배양 시스템은 기본 및 병진 연구 연구에 사는 예비 침습적 유방 종양 세포를 생성하는 새로운 모델을 구성한다. 과거에는, 전 악성 유방암의 진행은 일반적으로 세 가지 방법으로 연구되어왔다. 첫 번째 방법은 병리 조직 학적 및 microdissected 냉동 또는 고정 인간의 표본 12-14의 유전자 분석이다. 두 번째 방법은 인간 프리 침습성 유방암 병소 (15)와 유사한 것으로 생…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은에 의해 부분적으로 지원 (1) 국방부의 유방암 연구 프로그램 (미국 육군 의학 연구 수집 활동) #이 LAL에 W81XVVH-10-1-0781가 및 VE 상을, (2) 수잔 G. 코멘 재단 보조금 IR122224446는 LAL 및 VE합니다. 병리학 지원 및 조직의 매출 동시는 친절 이노 바 페어팩스 병리학 교실 박사 하산 Nayer 박사 Geetha A. 메네 제스, 박사 찰스 Bechert에 의해 제공되었다. 환자 동의 및 샘플 조달은 전문적 이노 바 페어팩스 병원 임상 연구 코디네이터 홀리 Gallimore, 헤더 Huryk, 그리고 에밀 카마르에 의해 인도되었다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
| 25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
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