Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Summary

Cultura primária de células de tecidos intactos utilizando Organóides proporciona um sistema modelo que imita o microambiente de multi-celular, in vivo. Foi desenvolvido um modelo de cultura livre de soro primário tecido epitelial da mama que perpetua linhagens de cultura de células mistas e exposições diferenciadas morfologia, sem rompimento do tecido enzimática. Organóides mama permanecer viáveis ​​por> 6 meses.

Abstract

Mama carcinoma ductal in situ (CDIS), por definição, é a proliferação de células epiteliais neoplásicas dentro dos limites do ducto mamário, sem ultrapassar a membrana basal colágeno. Enquanto DCIS é um precursor não-obrigatório para os cânceres de mama invasivos, os mecanismos moleculares e as populações de células que permitem a progressão para o câncer invasivo não são totalmente conhecidos. Para determinar se as células progenitoras, capazes de invasão existia dentro da população de células DCIS, desenvolvemos uma metodologia de recolha e cultura estéril tecido mamário humano no momento da cirurgia, sem interrupção enzimática do tecido.

Tecido mamário estéril contendo segmentos ductal é colhida a partir de tecido mamário extirpado cirurgicamente após exame anatomopatológico de rotina. Tissue contendo DCIS é colocado em meio rico em nutrientes, contendo antibióticos, soro livre, e transportadas para o laboratório de cultura de tecidos. O tecido mamário é mais dissected para isolar as áreas calcificadas. Vários pedaços de tecido da mama (Organóides) são colocados num volume mínimo de meio isento de soro num frasco com uma tampa removível e cultivadas numa incubadora de CO ₂ humidificado. Populações de células epiteliais e de fibroblastos emergir da organ�de após 10 – 14 dias. Mammospheres formam espontaneamente e em torno da monocamada de células epiteliais. Populações de células específicas podem ser colhidas directamente a partir do frasco, sem perturbar as células vizinhas. Nosso sistema de cultura de tecidos não-enzimática revela de forma confiável, as células progenitoras invasivos citogeneticamente anormais de CDIS humanos frescos.

Introduction

A proliferação de células epiteliais dentro dos limites de ductos mamários e alvéolos (carcinoma ductal in situ) é reconhecido como um precursor obrigatório para ductal invasivo e carcinoma lobular da mama. No entanto, os mecanismos moleculares e dinâmica de populações de células que permitem a progressão para o câncer invasivo são mal compreendidos. Elucidar os mecanismos de sobrevivência utilizadas pelas células do carcinoma da mama pré-invasivas, ou qualquer tumor pré-invasivo, pode revelar estratégias terapêuticas para matar, ou mesmo impedindo, neoplasias pré-invasivas ^1. No entanto, métodos de baixo custo simples para estudar funcionalmente lesões pré-invasivas humanos têm faltado. Embora a cultura in vitro em monocamada de linhas celulares transformadas é estabelecido um método de laboratório, o genótipo e o fenótipo destas linhas de células imortalizadas não recapitular o estatuto molecular de células de tumores humanos primários ^2. Além disso, mesmo a linha não-tumorigenic células MCF-10A, que recapitulates 3-D arquitetura da glândula mamária, não representam adequadamente o fenótipo funcional e as características moleculares do pré-invasivo lesão peito de um paciente individual ^3,4.

Para determinar se as células-tronco neoplásicas semelhantes capazes de invasão existiu dentro do carcinoma ductal in situ (CDIS) população de células, desenvolvemos uma metodologia de recolha e cultura estéril tecido mamário humano no momento da cirurgia (Figura 1) ^5. O nosso ex vivo da mama sistema de cultura organ�de não depende de interrupção enzimática tecido, extracto de membrana basal da matriz, ou o esgotamento de fibroblastos, para o isolamento e propagação de células formadoras de mammosphere de fresco humano de mama ductal tecido de carcinoma de ^6-8. O nosso novo sistema baseia-se no princípio da célula de fluxo / migração ^5. Os ductos mamários discerníveis, e estroma circundante estão submersos num volume mínimo de meio nutriente livre de soro (e apenasnough a cobrir os fragmentos de condutas) para maximizar a troca de gás, com a superfície de corte da conduta exposta ao meio de cultura, mas em qualquer orientação específica no balão (Figura 1E-F). Este sistema de cultura permite que as células migrem para fora da conduta e para dentro / para o balão de estroma e cultura autólogo. O meio nutriente, suplementado apenas com o Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), insulina, e antibióticos, suporta o crescimento de populações de células mistas que emanam do organ�de. O balão de cultura de tecidos tem um, re-selável tampa removível que permite que os Organóides e / ou células a serem colhidas, sem perturbar a totalidade do balão ou vizinhos Organóides, enquanto se mantém um ambiente estéril humidificada.

Protocol

Tecido mamário humano foi coletado de pacientes inscritos em um estudo de pesquisa, com consentimento informado por escrito, na sequência do Departamento de Defesa, George Mason University, e protocolos aprovados do Sistema de Saúde Inova Institutional Review Board. 1. Prepare Nutrient meio rico com fatores de crescimento e antibióticos Preparar soluções de reserva de insulina, factor de crescimento epidérmico (EGF), sulfato de estreptomicina e sulfato de gentamicina. <…

Representative Results

Fluxo de trabalho para a aquisição e cultura carcinoma ductal de mama estéril em tecido situ Esterilidade tecido mamário é mantida desde a sala de cirurgia para o laboratório de cultura de células via pequenas alterações no fluxo de trabalho típico de patologia do hospital (Figura 1). O tecido é transportado num recipiente esterilizado com um revestimento de película de plástico, que permite a avaliação radiológica, mantendo a esterilidade do t…

Discussion

O sistema de cultura aqui descrito constitui um novo modelo para a geração de células mamárias neoplásicas vivos pré-invasivas para estudos básicos e Pesquisa Translacional. No passado, a pré-maligno de progressão do cancro da mama tem sido tipicamente estudada usando três métodos diferentes. O primeiro método é histopatológico e análise genética de amostras microdissecadas humanos congelados ou fixados ^12-14. O segundo método utiliza modelos de mouse que contêm nódulos alveolares (HAN) les…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ethanol	Fisher	A405-P	prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water
18 MΩ-cm water, sterile filtered			sterile filtered, Type 1 reagent grade water
10cc plastic disposable syringe, sterile	BD	305482
0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile	Thermo Scientific	194-2520
15ml polypropylene conical tubes, sterile	Fisher	14-959-49B
50ml polypropylene conical tubes, sterile	Fisher	05-539-6
1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile	Fisher	02-681-331
nutrient medium, DMEM-F12/HEPES	Invitrogen	11330-032	with L-glutamine
Insulin, human recombinant	Roche	11376497001	10mg/ml stock
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant	Millipore	GF144	100µg/ml stock
Streptomycin sulfate	Sigma-Aldrich	S1567	10mg/ml stock
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G19114	10mg/ml stock
Filtration flask and filter top, sterile	Millipore	SCGPU02RE	0.22µm PES membrane
25ml sterile, disposable pipettes	Fisher	4489	paper-plastic wrapped
10ml sterile, disposable pipettes	Fisher	4488	paper-plastic wrapped
Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)	CDI	MD2000	after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard
Cotton tipped applicators, sterile	Fisher	23-400-115	single use only
Gauze pads, 10x10cm, sterile	Fisher	2187
Plastic transfer pipettes, sterile, disposable	Samco	202-20S
Vinegar, white distilled	household use		5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes
#10 scalpels, sterile, disposable	Thermo Scientific	31-200-32
petri dish, sterile	Fisher	FB0875713A
TPP 115cm2 flask, with removable lid	MidSci	90652	screw cap with filter
CO2 incubator	Fisher	13-998-074	5% CO2, 37 oC, humidified chamber
inverted light microscope	Olypmus	IX51
8M urea	Fisher	BP169-500	optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells
2X SDS tris-glycine buffer	Life Technologies	LC2676	optional, for proteomic analysis of cultured cells
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	optional, for preparing cell smears