אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres
Summary
תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל> 6 חודשים.
Abstract
קרצינומה של צינוריות שד באתרו (DCIS), בהגדרה, היא התפשטות של תאי אפיתל גידולים בתחומי צינוריות השד, מבלי לפרוץ את הקרום במרתף collagenous. בעוד DCIS הוא מבשר שאינו מחייב לסרטן שד פולשני, המנגנונים המולקולריים ואוכלוסיות תאים המאפשרים התקדמות לסרטן פולשני אינם ידועים במלואו. כדי לקבוע אם תאים מסוגלים פלישה היו קיימים בתוך אוכלוסיית תאי DCIS, שפיתחנו מתודולוגיה לאיסוף וculturing רקמת שד האנושי סטרילי בזמן הניתוח, ללא הפרעה אנזימטית של רקמה.
רקמת שד סטרילי המכילה קטעי ductal שנקטפו מרקמת שד שנכרת בניתוח לאחר בדיקה פתולוגית שגרתית. רקמה המכילה DCIS ממוקמת במדיום מזין עשיר, המכיל אנטיביוטיקה, סרום חופשי, ומועברת למעבדה תרבית רקמה. רקמת השד היא dissecte נוסףד לבודד את האזורים המסוידים. חתיכות מרובות רקמת שד (organoids) ממוקמות בנפח מינימאלי של מדיום סרום ללא בבקבוק עם מכסה נשלף ותרבותי בCO 2 באינקובטור humidified. אוכלוסיות תאי אפיתל ופיברובלסטים לצאת מorganoid לאחר 10-14 ימים. באופן ספונטני Mammospheres יוצר על ומסביב monolayer תאי אפיתל. ניתן לקצור אוכלוסיות תאים ספציפיות ישירות מהבקבוק מבלי לשבש תאים שכנים. מערכת התרבות שלנו אינה אנזימטית רקמה אמינה מגלה תאי cytogenetically חריגים, חודרניים אב מנגעי DCIS אנושיים טריים.
Introduction
התפשטות של תאי האפיתל בתחומי צינוריות שד וalveoli (קרצינומה ductal באתר) מוכרת כמבשר מחייב לductal פולשני וסרטן השד לובולרי. עם זאת, המנגנונים המולקולריים ודינמיקה של אוכלוסיות תאים המאפשרים התקדמות לסרטן פולשני הם הבינו היטב. הבהרת מנגנוני ההישרדות בשימוש על ידי תאים טרום-פולשנית סרטן השד, או כל גידול טרום פולשני, עשויה לחשוף אסטרטגיות טיפוליות להריגה, או אפילו מניעה, שאתות מראש פולשנית 1. עם זאת, שיטות עלות נמוכה פשוטות לנגעים טרום-פולשנית אנושיות תפקודי לומדים כבר חסרות. למרות שתרבות monolayer במבחנה של שורות תאים הפכו שיטת מעבדה הוקמה, פנוטיפ לבין הגנוטיפ של שורות תאים הונצחו אלה נכשל לשחזר את המצב המולקולרי של תאים סרטניים אנושיים ראשוניים 2. יתר על כן, אפילו שורת התאים שאינם סרטנית MCF-10A, שrecapitulates 3-D ארכיטקטורת בלוטת החלב, לא מייצגת את הפנוטיפ הפונקציונלי ומאפיינים מולקולריים של נגע השד מראש פולשנית של המטופל 3,4 כראוי.
כדי לקבוע אם תאי גידולים כמו גזע מסוגלים פלישה היו קיימים בתוך קרצינומה ductal באתרו (DCIS) אוכלוסיית תאים, שפתחנו מתודולוגיה לאיסוף וculturing רקמת שד האנושי סטרילי בזמן הניתוח (איור 1) 5. ex vivo מערכת תרבות organoid השד שלנו אינה מסתמכת על הפרעה אנזימטית רקמה, מטריצת תמצית קרום במרתף, או דלדול פיברובלסטים, לבידוד ומתפשט תאי יוצרי mammosphere מרקמת קרצינומה ductal שד האנושי הטרי 6-8. המערכת החדשה שלנו מבוססת על העיקרון של הזרמה / נדידת תאי 5. הצינורות ניכרו השד, וסטרומה מסביב שקועים בהיקף מינימאלי של מדיום מזין סרום ללא (רק דוארnough כדי לכסות את שברי הצינור) על מנת למקסם את חילוף גזים, עם פני השטח החתך של הצינור נחשף לתרבות בינונית, אבל בשום כיוון מסוים בבקבוק (איור 1E-F). מערכת זו התרבות מאפשרת לתאים לנדוד אל מחוץ לצינור ול/ על בקבוק סטרומה ותרבות אוטולוגי. בינוני המזין, בתוספת רק עם עוריות Growth Factor (EGF), אינסולין, ואנטיביוטיקה, תומך בצמיחה של אוכלוסיות תאים מעורבות שנכללו בגין את organoid. יש בקבוק תרבות רקמת מכסה המאפשר organoids ו / או התאים להיות שנקטפו מבלי לשבש את organoids הבקבוק או השכן כל, תוך שמירה על סביבת humidified סטרילי נשלף, מחדש סגר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת התרבות המתוארת כאן מהווה מודל חדש ליצירת תאי גידולים קדם-פולשנית המתגוררים שד למחקרים בסיסיים וtranslational. בעבר, התקדמות סרטן השד טרום ממארת יש בדרך כלל נחקרה תוך שימוש בשלוש שיטות שונות. השיטה הראשונה היא היסטופתולוגיות וניתוח גנטי של דגימות אנושיות קפוא או קבוע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי (1) שד משרד ההגנה תכנית לחקר סרטן (צבא ארה"ב למחקר רפואי רכישת פעילות) הפרס # W81XVVH-10-1-0781 לLAL וVE, ו- (2) מענק סוזן ג 'קומן הקרן IR122224446 לאל וVE. תמיכת פתולוגיה וגילום רקמה סופקו באדיבות על ידי Inova Fairfax פתולוגיה מחלקה, ד"ר חסן נייער, ד"ר גיתה א מנזס, ודר 'צ'ארלס בכרט. הסכמת מטופל ורכש מדגם מודרך במומחיות על ידי רכזי מחקר קליני Inova Fairfax בית החולים הולי Gallimore, הת'ר Huryk, ואמיל קמר.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
| 25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C. Preinvasive breast cancer. Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women’s Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D’amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
