Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
De C. elegans epidermis en cuticula vormen een eenvoudige, maar verfijnde huidlaag die gelokaliseerde schade als gevolg van het verwonden kan repareren. Studies wond reacties en reparatie dit model hebben ons begrip van het cytoskelet en genomische respons op weefselbeschadiging verlicht. De twee meest gebruikte methoden wond C. elegans volwassen huid prikt met micro-injectie naalden, en lokale laser bestraling. Naald verwonden plaatselijk verstoort de cuticula, epidermis en bijbehorende extracellulaire matrix, en kunnen ook interne weefsels beschadigen. Laser bestraling resulteert in meer gelokaliseerde schade. Verwonding veroorzaakt een opeenvolging van gemakkelijk getest reacties ontvangen, waaronder verhoogde epidermale Ca 2+ (seconden-minuten), de vorming en de sluiting van een actine-bevattende ring op de wond (1-2 uur), verhoogde transcriptie van antimicrobiële peptide genen (2-24 hr) en littekenvorming. In wezen zijn alle wild type volwassen dieren overleven verwonding, waarals mutanten defect in de wond reparatie of andere reacties tonen verminderde overleving. Gedetailleerde protocollen voor naald en laser verwonden en assays voor kwantificering en visualisatie van wond reacties en herstelprocessen (Ca dynamiek, actine dynamiek, antimicrobiële peptide inductie en overleving) gepresenteerd.
Introduction
Huid wondgenezing mechanismen zijn van fundamentele biologische interesse en voor de menselijke gezondheid relevant. Wondgenezing in gewervelde dieren en zoogdieren bestaat uit een complexe reeks gecoördineerde reacties van verschillende weefsels en signalering 1. Veel eenvoudige genetische model organismen zijn ook in staat om helende huidwonden 2. Het is daarom van belang genetisch handelbaar modellen huid wondheling analyseren. Wij en anderen hebben begonnen Caenorhabditis elegans als nieuw model voor de huid wondgenezing 3,4. Het doel van dit protocol is om een bredere reeks van onderzoekers aan C. gebruiken mogelijk elegans als een instrument om de moleculaire en cellulaire mechanismen van epidermale wondgenezing te onderzoeken.
De C. elegans huid omvat de epidermis (ook bekend als hypodermis) en het extracellulaire cuticula 5. De volwassen epidermis gevormd uit een klein aantal meerkernige syncytia, waarvan de grootste de syncytium known als hyp7. De epidermis is een eenvoudige epitheel dat de cuticula van het apicale oppervlak afscheidt. De huid kan actief verdedigen tegen-huid doordringende ziekteverwekkers en repareren kleine wondjes 4. Wondherstel van de C. elegans huid is robuust, aangezien bijna alle wild type dieren overleven kunnen kleine wondjes veroorzaakt door naalden, of lokale beschadiging van de huid veroorzaakt door laser bestraling overleven. C. elegans huid verwonding veroorzaakt een reeks van reacties, met inbegrip van een epidermale aangeboren immuunrespons, wondsluiting en littekenvorming 4. De volwassen epidermis post-mitotische en wondheling omvat lokale cellulaire responsen in tegenstelling tot epidermale proliferatie of celmigratie. We hebben aangetoond dat de huid verwonding veroorzaakt een aanzienlijke en aanhoudende groei van epidermale Ca2 +, waarbij het membraan TRPM kanaal GTL-2 en interne Ca2 + stores 3. De epidermale Ca2 + signaal nodig voor oprichting en sluiting van F-actine ringen aan de wound website. Verwonding induceert ook aangeboren immuunrespons dat de transcriptie van AMPs zoals NLP-29 te activeren. De verwonding geïnduceerde transcriptie van AMPs is afhankelijk van een TIR-1 / PMK-1 p38 MAP kinase cascade autonoom handelen in de epidermis 4. Defecten in ofwel de Ca 2+ signaleringsroute of in de aangeboren immuunrespons zal leiden tot lagere overleving na de verwonding. De relatief eenvoudige structuur van het C. elegans epidermis, zijn genetische handelbaarheid en voordelen voor in vivo beeldvorming maakt het een uitstekend systeem om meerdere aspecten van wondheling te bestuderen.
Hier presenteren we protocollen voor de twee gebruikelijke methoden van verwonding: naald verwonden en laser verwonden. Naald verwonding vereist geen speciale apparatuur (met uitzondering van de naald trekker), en met ervaring kan worden uitgevoerd op honderden wormen per dag. Naald verwonding wordt uitgevoerd op dieren groeien op agarplaten. Daarentegen wordt laser verwonding uitgevoerd op anesthetized dieren aangebracht op agar kussentjes onder een dekglaasje en is geschikt voor levende beeldvorming van de cellulaire respons op beschadiging.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde van naald en laser verwonding werkwijzen complementaire werkwijzen om het vermogen van de epidermale epitheel schade te herstellen. Laser verwonding is relatief gelokaliseerde en (afhankelijk van de laser configuratie) kan worden beperkt tot de epidermis, terwijl naald verwonding verstoort de opperhuid, cuticula, en waarschijnlijk interne basaalmembranen. Naald verwonding kan nauwkeuriger lijken wonden toegebracht door pathogenen of mechanische schade in de natuurlijke omgeving. In de regel naald …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
