Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
El C. elegans epidermis y cutícula forman una sencilla capa de piel y sofisticado que puede reparar daños localizados resultante de la herida. Los estudios de las respuestas de la herida y la reparación en este modelo han iluminado nuestro entendimiento del citoesqueleto y respuestas genómicas a daños en los tejidos. Los dos métodos más comúnmente utilizados para lesionar al C. elegans piel del adulto son pinchazos con agujas de microinyección y la irradiación láser local. Aguja hiriendo localmente altera la cutícula, la epidermis, y la matriz extracelular asociada, y también puede dañar los tejidos internos. Resultados de irradiación láser en daños más localizado. Heridas desencadena una sucesión de respuestas ensayadas fácilmente incluyendo elevada epidérmica Ca 2+ (segundo minutos), la formación y el cierre de un anillo que contiene actina en el sitio de la herida (1-2 horas), elevado transcripción de genes de péptidos antimicrobianos (2-24 hr), y la formación de cicatrices. Esencialmente, todos los animales adultos silvestres sobreviven herida, dondecomo mutantes defectuosos en la reparación de heridas u otras respuestas muestran una menor supervivencia. Se presentan los protocolos detallados de aguja y las heridas de láser, y ensayos para la cuantificación y visualización de las respuestas de la herida y los procesos de reparación (dinámica de Ca, la dinámica de actina, la inducción péptido antimicrobiano y supervivencia).
Introduction
Mecanismos de curación de heridas en la piel son de interés biológico básico y relevante para la salud humana. La cicatrización de heridas en los vertebrados y mamíferos comprende una compleja serie de respuestas coordinadas de múltiples tejidos y de señalización 1. Muchos simples organismos modelo genético también son capaces de curar las heridas de la piel 2. Por tanto, es de interés analizar modelos genéticamente tratables de la reparación de heridas de la piel. Nosotros y otros han comenzado a utilizar Caenorhabditis elegans como nuevo modelo para la curación de heridas de la piel 3,4. El objetivo de este protocolo es permitir a un conjunto más amplio de investigadores de utilizar C. elegans como una herramienta para investigar los mecanismos moleculares y celulares de la epidermis cicatrización de la herida.
El C. piel elegans comprende la epidermis (también conocidos como hipodermis) y la cutícula extracelular 5. La epidermis adulto se forman a partir de un pequeño número de sincitios multinucleados, de los cuales el más grande es el sincitio known como hyp7. La epidermis es un epitelio simple que segrega la cutícula en su superficie apical. La piel puede defenderse activamente contra los patógenos que penetran en la piel y reparar pequeñas heridas 4. La reparación de heridas de la C. piel elegans es robusta, ya que casi todos los animales de tipo salvaje sobreviven pueden sobrevivir pequeñas heridas punzantes causadas por agujas o daño local de la piel causada por la irradiación láser. C. heridas de la piel elegans desencadena una serie de respuestas, incluyendo una respuesta inmune innata epidérmico, cierre de la herida, y la formación de cicatrices 4. La epidermis adultos es post-mitótico, y cicatrización de heridas implica respuestas celulares locales en oposición a la proliferación epidérmica o la migración celular. Hemos demostrado que las heridas de la piel provoca un aumento grande y sostenido en epidérmica Ca 2+, requiriendo el canal de TRPM membrana GTL-2 e internos Ca 2 + tiendas 3. Se requiere señal El epidérmica Ca 2+ para la formación y el cierre de los anillos F-actina en el wositio und. Heridas también induce la respuesta inmune innata que activan la transcripción de AMPs como PNL-29. La transcripción inducida por heridas de AMP depende de una TIR-1 / PMK-1 p38 MAP quinasa cascada que actúa de forma autónoma en la epidermis 4. Los defectos en cualquiera de la vía de señalización de Ca2 + o en la respuesta inmune innata dará lugar a una menor supervivencia después de la herida. La estructura relativamente simple de la C. elegans epidermis, su maleabilidad genética y ventajas en vivo de imágenes hacen que sea un excelente sistema para estudiar varios aspectos de la reparación de la herida.
Aquí presentamos los protocolos para los dos métodos comunes de heridas: las heridas de aguja y lesiones láser. Herida de la aguja no requiere equipo especializado (que no sea el extractor de aguja), y con la experiencia se puede realizar en cientos de gusanos por día. Heridas de aguja se realiza en animales en crecimiento en placas de agar. Por el contrario, las heridas de láser se realiza en Anesanimales anestesiados montados en agar almohadillas bajo un cubreobjetos, y es adecuado para imágenes en vivo de las respuestas celulares a los daños.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos presentados aquí por aguja y lesiones láser ofrecen enfoques complementarios para evaluar la capacidad del epitelio epidérmico para reparar los daños. Herida láser es relativamente localizado y (dependiendo de la configuración del láser) puede limitarse a la epidermis, mientras que la herida de la aguja interrumpe la epidermis, la cutícula, y membranas basales internos probables. Heridas de aguja puede parecerse más precisión las heridas infligidas por agentes patógenos o daños mecánicos en el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
References
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