Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
Il C. elegans epidermide e cuticola formano uno strato di pelle ma sofisticato semplice che può riparare i danni localizzati derivanti da ferire. Studi di risposte ferita e riparazione di questo modello hanno illuminato la nostra comprensione del citoscheletro e risposte genomiche per danni ai tessuti. I due metodi più comunemente usati per la ferita C. elegans pelle adulta sono punture con aghi microiniezione e irraggiamento laser locale. Ago ferendo localmente interrompe la cuticola, epidermide, e matrice extracellulare associati, e può anche danneggiare i tessuti interni. Risultati irradiazione laser a danni più localizzato. Ferimento innesca una serie di reazioni prontamente analizzati, tra cui elevata epidermica Ca 2+ (secondi minuti), la formazione e la chiusura di un anello-actina contenenti presso il sito della ferita (1-2 ore), elevata la trascrizione di geni peptidi antimicrobici (2-24 hr), e formazione di cicatrici. In sostanza tutti gli animali adulti wild type sopravvivono ferimento, dovecome mutanti difettose nella riparazione delle ferite o altre risposte mostrano ridotta sopravvivenza. Vengono presentati i protocolli dettagliati per ago e il ferimento laser, e saggi per la quantificazione e la visualizzazione delle risposte della ferita e dei processi di riparazione (dinamica Ca, dinamiche actina, induzione peptide antimicrobico, e la sopravvivenza).
Introduction
Pelle ferita meccanismi di guarigione sono di interesse biologico di base e rilevanti per la salute umana. La guarigione delle ferite nei vertebrati e mammiferi comprende una complessa serie di risposte coordinate di diversi tessuti e di segnalazione 1. Molti semplici organismi modello genetico sono anche in grado di guarire le ferite della pelle 2. È quindi interessante analizzare modelli geneticamente trattabili di riparazione delle ferite della pelle. Noi e altri abbiamo iniziato a utilizzare Caenorhabditis elegans come nuovo modello per la pelle ferita guarigione 3,4. L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire una più ampia serie di ricercatori da utilizzare C. elegans come strumento per indagare i meccanismi molecolari e cellulari della epidermica guarigione delle ferite.
Il C. pelle elegans comprende l'epidermide (noto anche come ipoderma) e la cuticola extracellulare 5. L'epidermide adulto è formato da un piccolo numero di sincizi multinucleate, di cui il più grande è il sincizio known come hyp7. L'epidermide è un epitelio semplice che secerne cuticola sulla sua superficie apicale. La pelle può difendere attivamente contro gli agenti patogeni-pelle penetrante e riparare piccole ferite 4. Riparazione della ferita del C. pelle elegans è robusto, come quasi tutti i tipi di animali selvatici sopravvivono possono sopravvivere piccole punture provocate da aghi, o danni alla pelle locale causati da irraggiamento laser. C. elegans pelle ferimento innesca una serie di reazioni, tra cui una risposta epidermica innata immunitaria, la chiusura della ferita, e la formazione di cicatrici 4. L'epidermide adulti è post-mitotico, e la guarigione delle ferite comporta risposte cellulari locali in contrasto con la proliferazione epidermica o la migrazione delle cellule. Abbiamo dimostrato che il ferimento pelle innesca un grande e costante aumento in epidermica Ca 2+, che richiede il canale di membrana TRPM GTL-2 e interni di Ca 2+ negozi 3. Il segnale è richiesto epidermica Ca 2+ per la formazione e la chiusura di anelli F-actina al wound sito. Ferimento induce anche le risposte immunitarie innate che attivano la trascrizione di AMP, come la PNL-29. La trascrizione ferimento indotto di AMP è dipendente da un TIR-1 / PMK-1 p38 MAP chinasi cascade agire autonomamente nell'epidermide 4. Difetti in entrambi la segnalazione via Ca 2+ o nella risposta immunitaria innata porterà alla sopravvivenza inferiore post-ferimento. La struttura relativamente semplice del C. elegans epidermide, la sua trattabilità genetica e vantaggi per imaging in vivo ne fanno un sistema eccellente per studiare i molteplici aspetti di riparazione delle ferite.
Qui vi presentiamo i protocolli per i due metodi comuni di ferimento: ferimento ago e ferimento laser. Ferimento dell'ago non richiede attrezzature specializzate (diverso estrattore ago), e con esperienza può essere eseguita su centinaia di vermi al giorno. Ferimento ago viene eseguita su animali in crescita su piastre di agar. Al contrario, ferimento laser viene eseguita su anesanimali thetized montati su agar pad sotto un coprioggetto, ed è adatto per l'imaging dal vivo delle risposte cellulari al danno.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi qui presentati per ago e ferimento laser offrono approcci complementari di valutazione della capacità dell'epitelio epidermica per riparare i danni. Ferimento laser è relativamente localizzato e (a seconda della configurazione laser) può essere limitato l'epidermide, mentre ferimento ago sconvolge l'epidermide, cuticola, e probabilmente membrane basali interni. Ago ferimento può assomigliare più accuratamente le ferite inflitte da agenti patogeni o danni meccanici in ambiente naturale. Come reg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
References
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