Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em> C. Элеганс</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
C. Элеганс эпидермис и кутикула образует простой, но сложный слой кожи, который может исправить локализованное повреждение в результате ранения. Исследования ответов раны и ремонта в этой модели с подсветкой наше понимание цитоскелета и геномных ответов на повреждение ткани. Два наиболее часто используемые методы ранить С Элеганс взрослых кожей уколы с микроинъекции иглы и локальном лазерном облучении. Игла ранение локально разрушает кутикулу, эпидермис и внеклеточный матрикс, связанный, а также может привести к повреждению внутренних тканей. Результаты лазерного облучения в более локализованной повреждений. Ранение вызывает последовательность легко определить реакции, включая повышенной эпидермиса Ca 2+ (секунды-минуты), формирование и замыкании актин-содержащие кольца на месте раны (1-2 ч), повышенная транскрипции антимикробных генов пептид (2-24 ч), и формирование рубца. Практически все взрослые животные дикого типа выжить ранения, гдекак мутанты с дефектом в заживления раны или других ответов показывают снижением выживаемости. Подробные протоколы для иглы и лазерной ранения, и анализы для количественного и визуализации раневых реакций и процессов репарации (Ca динамики, динамики актина, антимикробной индукции пептидов и выживания) представлены.
Introduction
Кожные заживления ран механизмы основных биологических интереса и отношение к здоровью человека. Заживление ран у позвоночных и млекопитающих представляет собой сложную серию скоординированных реакций многих тканях и сигнализации 1. Многие простые генетические модели организмы также способны заживления ран кожи 2. Поэтому представляет интерес анализ генетически послушный модели кожной раны ремонта. Мы и другие начали использовать Caenorhabditis Элеганс как новая модель кожной раны исцеление 3,4. Цель этого протокола заключается в обеспечении более широкого набора исследователям использовать C. Элеганс как инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов эпидермиса заживления ран.
C. Элеганс кожи включает в себя эпидермис (также известные как гиподермы) и внеклеточный кутикулу 5. Взрослые эпидермиса образуется из небольшого числа многоядерных синцитиев, из которых крупнейшим является синцитиально кNown как hyp7. Эпидермис просто эпителий, что выделяет кутикулу на вершинной поверхности. Кожа может активно защищаться от кожи, проникая патогенов и ремонта небольших ран 4. Рана ремонт С Элеганс кожа является надежным, так как почти все дикие типа животных выжить могут выжить небольшие проколы, вызванные иглами, или локальное повреждение кожи под действием лазерного облучения. C. Элеганс кожи ранение вызывает набор ответов, в том числе эпидермального врожденного иммунного ответа, заживления раны и образования рубца 4. Взрослые эпидермис постмитотическими, и заживление ран включает в себя местные клеточные реакции в отличие от распространения эпидермиса или миграции клеток. Мы показали, что кожа ранение вызывает большой и устойчивый рост в эпидермальных Ca 2+, требуя мембрана TRPM канал GTL-2 и внутренние Ca 2+ магазины 3. Сигнал эпидермального Ca 2+ необходим для формирования и закрытия F-актина колец на WOунд сайт. Ранение также вызывает врожденные иммунные реакции, которые активируют транскрипцию АМП, такие как НЛП-29. Ранений, вызванных транскрипции усилителей зависит от МДП-1 / ПМК-1 р38 МАР-киназы каскада, действующего автономно в эпидермисе 4. Дефекты в любом сигнального пути Ca 2+ или в врожденного иммунного ответа приведет к снижению выживаемости после ранения. Относительно простой структурой С. Элеганс эпидермис, его генетический уступчивость и преимущества для в естественных изображений делают его отличным систему для изучения различных аспектов заживления ран.
Здесь мы представляем протоколы для двух распространенных методов ранения: иглы ранения и лазерной ранения. Игла ранение не требует специального оборудования (кроме иглы съемника), а с опытом можно выполнить на сотни червей в день. Игла ранения осуществляется на животных, растущих на чашках с агаром. В отличие от этого, лазерное нанесение ран выполняется на Anesthetized животные установлен на агар Рамки под покровное, и подходит для живого изображения клеточных реакций на повреждение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, представленные здесь иглой и лазерной ранения обеспечивают дополнительные подходы к оценке способности эпидермиса эпителия для ремонта повреждений. Лазерная ранение относительно локализованными и (в зависимости от лазерного конфигурации) может быть ограничен эпидермиса, в ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
