JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

استراتيجيات لتتبع القيامة، خلية بقاء ظاهرة التي عكس موت الخلايا المبرمج

Published: February 16, 2015
doi:
10.3791/51964
, , ,
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology,Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences,Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

القيامة (اليونانية ل "ارتفاع في الحياة") يشير إلى انتعاش الخلايا الميتة. قبل هذه الخلايا على التعافي، وأنها مرت عبر نقاط التفتيش مهمة من موت الخلايا المبرمج، بما في ذلك تجزئة الميتوكوندريا، وإطلاق سراح من الميتوكوندريا السيتوكروم ج في العصارة الخلوية، وتفعيل caspases، والتكثيف لونين، الحمض النووي من التلف، والتجزؤ النووي، blebbing غشاء البلازما، وانكماش الخلايا، والتعرض سطح الخلية من فسفاتيديل، وتشكيل هيئات أفكارك. يمكن أن يحدث القيامة عندما تتم إزالة المثيرات أفكارك قبل الموت، مما يسمح الخلايا الميتة لعكس موت الخلايا المبرمج وآليات الموت يحتمل الأخرى. لذلك، يظهر القيامة لإشراك عمليات الشفاء الفسيولوجية التي يمكن أيضا أن الحفاظ على الخلايا التالفة بشكل غير لائق. وظائف وآليات القيامة لا تزال غير واضحة، عرقل في جزء من أدوات محدودة للكشف عن الأحداث الماضية بعد التعافي من خلايا سليمة ظاهريا. استراتيجيات للكشف عن anastaوجهاز الأمن والمخابرات تمكين دراسات الآليات الفسيولوجية، والمخاطر الخلايا أوندد في علم الأمراض المرض، والعلاجات المحتملة لتعديل القيامة. هنا، نحن تصف استراتيجيات فعالة باستخدام المجهر الخلايا الحية وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس الثدييات لتحديد وتتبع القيامة في خلايا الثدييات.

Introduction

موت الخلايا المبرمج (اليونانية ل "يسقط إلى الموت") يفترض عموما أن يكون عملية ذات اتجاه واحد تنتهي في خلية انتحارية 1-7. اضطراب وراثي للجينات النتائج المؤيدة للوفاة في بقاء الخلايا الإضافية التي من شأنها أن يموت على خلاف ذلك في الحيوانات كلها، بما في ذلك الخلايا التي بدأت بالفعل 8،9 مسار موت الخلايا المبرمج. وبالمثل، التلاعب الجيني تسمح خلايا الثدييات الصحية التي تعرض بشكل مصطنع "أكل لي" إشارات أو التي تفقد الإلتصاق إلى مصفوفة من خارج الخلية إلى الهروب الموت البلعمة خلية كاملة أو entosis، على التوالي 10،11. ومع ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أنه من دون التلاعب الجيني خلايا الثدييات صحية طبيعية وخطوط الخلايا يمكن أيضا استرداد من المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج 12-15. استخدام أدوات لتتبع الخلايا الفردية، ولقد أثبتت مزيد من التعافي من المراحل المتأخرة من موت الخلايا المبرمج 12،13، بعد مرور خلايا نقاط التفتيش الهامة التي نموذجيةلاي بمناسبة "نقطة اللاعودة" 2-6. وتشمل هذه الحواجز من أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج، وتفعيل caspases، والتجزؤ النووي، وتشكيل هيئات أفكارك. اعتمدنا كلمة مركبة اليونانية "القيامة"، وهو ما يعني "ارتفاع في الحياة"، لوصف هذا عكس موت الخلايا المبرمج على شفا موت الخلية 2-6.

إلا إذا لوحظ عملية استرداد الموت بأكملها من خلال تصوير الخلايا الحية، فإنه يمثل تحديا للتمييز الخلايا التي خضعت القيامة من الخلايا التي لم يشهد الأحداث أفكارك. وقد كشفت عقود من العمل أن السمات المورفولوجية للانتحار الخلية عن طريق الخلايا هي التي تحرك الأحداث البيوكيميائية والجزيئية الحفظ تطويريا 16-19. هذه الأحداث تعزز التدمير الذاتي للخلايا لتنظيم العمليات التنموية وhomoeostatic في الكائنات وحيدة الخلية ومتعددة الخلايا من خلال القضاء على تلف أو دخلايا angerous 16-19. في حين أن الخلايا أفكارك يمكن تمييزها بسهولة من المظاهر الشكلية، والكيمياء الحيوية والجزيئية موحدة للموت الخلايا المبرمج 1،5،6،16،20، حاليا لا يوجد أي علامة معروفة محددة لالقيامة 12،13. الأهم من ذلك، تظهر الخلايا التي خضعت القيامة لتكون الخلايا السليمة العادية، والخلايا التي تبدأ فقط عكس موت الخلايا المبرمج تظهر الخلايا أفكارك كما الموت 12،13. وبالتالي، هناك حاجة إلى أدوات جديدة لإبرام مع اليقين أن خلية على قيد الحياة نظرا قد شهدت في السابق عمليات أفكارك النشطة.

ويفترض موت الخلايا المبرمج عموما باعتباره سلسلة لا رجعة فيها لأنها عملية التدمير السريعة والواسعة النطاق. في حين ان الامر قد يستغرق دقائق إلى أيام لبعض الخلايا لبدء موت الخلايا المبرمج، بمجرد الإفراج الميتوكوندريا عوامل apoptogenic مثل السيتوكروم ج في العصارة الخلوية 21،22، يمكن تنشيط caspases خلال 5 دقائق 23،24، تليها حشوية والتكثيف النووي في غضون 10 دقيقة 25-27، وموت الخلايا بعد ذلك بوقت قصير 25-27. caspases تنشيط الانسجام موت الخلايا المبرمج من قبل الشق وتعطيل المكونات الهيكلية والوظيفية الرئيسية لغرض هدم الخلوي 2،28، مثل مثبطات نوكلياز داخلية DFF45 / ICAD 29،30. أيضا تفعيل Caspases العوامل المؤيدة لأفكارك، مثل BID عضو BCL-2 الأسرة، التي translocates إلى الميتوكوندريا لتعزيز الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج 31،32. النتائج النشاط كاسباس أيضا في التعرض سطح الخلية من فسفاتيديل بأنه "أكل لي" إشارة لتعزيز ابتلاع الموت الخلايا الضامة أو الخلايا المجاورة من خلال 33 البلعمة. وعلاوة على ذلك، والأحداث أفكارك تجعل الميتوكوندريا المختلة وظيفيا، وتعطيل الطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي 34،35،36. وهكذا، يبدو من غير المحتمل بشكل حدسي الشفاء من هذا التدمير.

وعلى عكس الأصلي نتوقعations، يمكن للخلايا عكس عملية موت الخلايا أفكارك حتى في مرحلة متأخرة. من خلال المراقبة المستمرة مصير الموت الخلايا في الثقافة، لاحظنا عكس من أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج في مجموعة من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا 12،13. إزالة الحوافز الموت سمحت التعافي من الميزات العلنية من موت الخلايا المبرمج، مثل تجزئة الميتوكوندريا، والتكثيف لونين، الحمض النووي من التلف، والبلازما blebbing الغشاء، والتعرض سطح الخلية من فسفاتيديل، وإطلاق سراح من الميتوكوندريا السيتوكروم ج، وتفعيل كاسباس، والتجزؤ النووي، انكماش الخلية، وتشكيل هيئات أفكارك. هذه الملاحظات تثير علامات الاستفهام بشأن الوظائف، والعواقب، وآليات القيامة. لمعالجة هذه المسائل، وهو شرط أساسي هو تحديد موثوق الخلايا التي خضعت القيامة. هنا، نحن تصف أساليب الفحص المجهري المباشر وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس للكشف عن الخلايا التي قد عكس في السابق أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج والعشريننجا أون.

Protocol

1. إعداد الخلايا ليعيش التصوير خلية لتسهيل الكشف عن التغيرات المورفولوجية، واختيار الخلايا الملتصقة مثل هيلا (سرطان عنق الرحم البشري) الخلايا التي هي شقة على الركيزة لتصور أفضل تغيير في غشاء البلازما وعضيات داخل الخل…

Representative Results

لدراسة عكس موت الخلايا المبرمج، وأول تتعرض الخلايا زراعة الأنسجة لحافز الموت لتحريك موت الخلايا المبرمج. عندما تعرض الخلايا بصمات موت الخلايا المبرمج، ثم يتم تطبيق ثقافة جديدة المتوسطة ليغسل التحفيز ثم احتضان الخلايا الميتة للسماح الاسترداد (الشكل 1A). هنا?…

Discussion

القيامة يشير إلى ظاهرة حيث الخلايا التي تم تنشيطها مسار موت الخلايا بعد ذلك عكس عملية الموت والبقاء على قيد الحياة. هنا، لقد أثبتنا أن تصوير الخلايا الحية يمكن أن تستخدم للتأكد من أن الخلايا الفردية نفسها في الواقع يمكن عكس أفكارك عملية موت الخلايا في مرحلة متأخرة، و…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر القس الدكتور رالف Bohlmann والقس الدكتور جيمس Voelz لاقتراح كلمة "القيامة" لوصف عكس موت الخلايا المبرمج. دوغلاس R. الأخضر للخلايا هيلا معربا عن ستابلي السيتوكروم ج -GFP. تشارلز M. رودين واريك E. غاردنر لH446 خلايا. هيذر لامب للمساعدة في الرسوم المتحركة الرسم في الفيديو؛ يي هوى يو لمناقشة قيمة هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل زمالة السير إدوارد Youde التذكارية (HLT)، ومنح الدراسية الدكتور والتر Szeto التذكارية (HLT)، منحة فولبرايت 007-2009 (HLT)، زمالة مؤسسة أبحاث علوم الحياة (HLT)، NIH منح NS037402 (JMH) وNS083373 (JMH)، ولجنة المنح الجامعية من هونغ كونغ اوي / B-07/99 (قدم مكعبة). هو لام تانغ هو مؤسسة زميل Shurl وكاي كورتشي لمؤسسة بحوث علوم الحياة.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss /
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O’Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Tags

AnastasisCell SurvivalApoptosisCell DeathMitochondrial FragmentationCaspase ActivationChromatin CondensationDNA DamageCell Surface PhosphatidylserineApoptotic BodiesLive Cell MicroscopyCaspase Biosensor
check_url/51964?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image