Стратегии для слежения Воскресения, выживание феномен клеточной который меняет апоптоз

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

Воскресение Христово (греч для "растет к жизни") относится к восстановлению умирающих клеток. Прежде, чем эти клетки восстановить, они прошли через важные контрольно-пропускных пунктов апоптоза, в том числе митохондриальных фрагментации, освобождения митохондриального цитохрома С в цитозоль, активацией каспаз, конденсацию хроматина, повреждение ДНК, ядерной фрагментации, плазменные мембраны блеббинга, мобильный усадки, воздействия на клеточной поверхности фосфатидилсерина, и формирование апоптотических тел. Воскресение может произойти, если апоптические стимулы удаляются до смерти, позволяя тем самым умирающие клетки обратной апоптоз и потенциально другие механизмы смерти. Таким образом, Воскресение-видимому, включает физиологические процессы заживления, которые также могут поддержания поврежденные клетки не по назначению. Функции и механизмы Воскресения до сих пор неясны, препятствует частично ограниченных инструментов для обнаружения прошлые события, произошедшие после восстановления здоровых клеток. Стратегии для обнаружения AnastaSIS позволит исследования физиологических механизмов, опасности нежити клеток в патологии болезни и потенциальные терапевтические модулировать Воскресения. Здесь мы опишем эффективные стратегии с использованием живых микроскопии клеток и млекопитающих каспазы биосенсора для выявления и отслеживания Воскресения в клетках млекопитающих.

Introduction

Апоптоз (по-гречески "падения до смерти"), как правило, предполагается, что односторонний процесс заканчивается в самоубийство клеток ^1-7. Генетический сбой про-смерти генов приводит к выживанию дополнительных клеток, которые могли бы умереть в целых животных, в том числе клеток, которые уже приступили к апоптоза ^8,9. Кроме того, генетические манипуляции позволяют здоровые клетки млекопитающих, которые искусственно отображения "Съешь меня" сигналы или которые теряют адгезией к их внеклеточного матрикса, чтобы избежать смерти по всей фагоцитоза клеток или Энтоз, соответственно ^10,11. Тем не менее, мы и другие показали, что без генетических манипуляций нормальных здоровых клетках млекопитающих и клеточные линии также может выйти из ранних стадиях апоптоза ^12-15. Использование инструментов для отслеживания отдельных клеток, мы еще больше продемонстрировали восстановление от поздних стадиях апоптоза ^12,13, после клетки были приняты важные контрольные точки, которые типичныLY отметить «точку невозврата» ^2-6. Эти контрольно-пропускные пункты позднего апоптоза этапе, включают митохондриальную выпуск цитохрома С, активацию каспаз, фрагментация ядер, и формирование апоптотических телец. Мы приняли греческую составное слово "Воскресение", что означает "рост к жизни", чтобы описать это обращение апоптоза на грани гибели клеток ^2-6.

Если весь процесс умирание-восстановление не наблюдалось изображений живых клеток, это вызов, чтобы отличить клетки, которые прошли Воскресения из клеток, которые никогда не испытывали апоптоза события. Десятилетия работы показали, что морфологические особенности клеток самоубийства путем апоптоза движет эволюционно консервативных биохимических и молекулярных событий ^16-19. Эти мероприятия способствуют самоуничтожение клеток регулировать развития и homoeostatic процессы в одноклеточных и многоклеточных организмов путем устранения повреждения или dс опасными клетки ^16-19. В то время как апоптотических клеток может быть легко отличить от стандартных морфологических, биохимических и молекулярных проявлений апоптоза ^1,5,6,16,20, в настоящее время нет никакого известного маркера специфичные для Воскресения ^12,13. Важно отметить, что клетки, которые подверглись анастасис оказаться нормальные здоровые клетки, и клетки, которые просто начать вспять апоптоз появляются как апоптические умирающих клеток ^12,13. Таким образом, новые инструменты необходимы заключить с уверенностью сказать, что данный выживания клеток ранее испытывали активные апоптоза процессы.

Апоптоз, как правило, рассматривается в качестве необратимой каскада, потому что это быстрое и массовое процесса уничтожения. В то время как это может занять несколько минут до нескольких дней для некоторых клеток, чтобы начать апоптоз, как только митохондрии выпустили апоптогенных такие факторы, как цитохром С в цитозоль ^21,22, каспазы может быть активирована в течение 5 минут ^23,24, а затем цитоплазматических иядерная конденсация течение 10 мин ^25-27, и гибель клеток вскоре после ^25-27. Активированные каспазы организовать апоптоз путем расщепления и инактивации ключевых структурных и функциональных компонентов для целей клеточной сноса ^2,28, такие как эндонуклеазы ингибитора DFF45 / ИАП ^29,30. Каспазы активировать проапоптотического факторы, такие как член BID BCL-2 семейства, которые транслоцируется митохондрий содействовать митохондрий высвобождается цитохром С. ^31-32. Активность каспазы также приводит к воздействию клеточной поверхности фосфатидилсерина, как «Съешь меня» сигнала для продвижения полном охвате смерти клеток макрофагами или соседними клетками посредством фагоцитоза ^33. Кроме того, апоптические события оказывают митохондрии неблагополучных, нарушая клеточные биоэнергетику и метаболизм ^34,35,36. Таким образом, выход из такого уничтожения интуитивно кажется маловероятным.

В отличие от оригинала ожидатьдимости клетки могут повернуть вспять процесс апоптоза клеточной смерти, даже на поздней стадии. Путем непрерывного мониторинга судьбу умирают клетки в культуре, мы наблюдали обратимость конце стадии апоптоза в диапазоне первичных клеток и клеточных линий ^12,13. Удаление смертной стимула позволила восстановить от явных признаков апоптоза, таких как митохондриальной фрагментации, конденсации хроматина, повреждение ДНК, плазматической мембраны, блеббинга, клеточной поверхности контакта фосфатидилсерина, выпуск митохондриальной цитохром с, активации каспазы, ядерной фрагментации, мобильный усадки, и формирование апоптотических телец. Эти наблюдения поднять без ответов вопросы, касающиеся функций, последствий и механизмов Воскресения. Для решения этих вопросов, условием является, чтобы надежно идентифицировать клетки, которые прошли Воскресения. Здесь мы опишем живые методы микроскопии и каспазы биосенсора для выявления клеток, которые ранее обратную поздней стадии апоптоза и еан выжил.

Protocol

1. Подготовка клетки для живых клеток изображений Для облегчения обнаружения морфологических изменений, выберите прилипшие клетки, такие как клетки HeLa (рак шейки матки человек) клеток, которые являются плоскими на подложке, чтобы лучше визуализировать изменение плазматической м…

Representative Results

Для изучения разворот апоптоза, культуры тканей клетки сначала подвергаются смертной стимул, чтобы вызвать апоптоз. Когда клетки отображения признаки апоптоза, свежую культуральную среду затем применяется, чтобы смыть стимул, а затем инкубируют умирающие клетки, чтобы позволить восс…

Discussion

Воскресение Христово относится к явлению, когда клетки, у которых активирована гибель клеток пути впоследствии обратить вспять процесс смерти и выжить. Здесь мы показали, что визуализация живых клеток могут быть использованы для подтверждения того, что одни и те же индивидуальные кле?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LSM780 confocal microscopy	Carl Zeiss	/
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Transparent CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 independent medium	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
Fluorescently labeled annexin V	Biovision	K201