Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

Anastasis (griechisch für "Rising to life") bezieht sich auf die Wiederherstellung von sterbenden Zellen. Bevor diese Zellen zu gewinnen, sie durch wichtige Kontrollpunkte der Apoptose, einschließlich mitochondriale Fragmentierung, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, Aktivierung von Caspasen, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Kernfragmentierung, Plasmamembran Blasenbildung, Zellschrumpfung, Zelloberflächenexposition bestanden haben Phosphatidylserin und Bildung von apoptotischen Körpern. Anastasis kann auftreten, wenn apoptotische Reize vor dem Tod entfernt, wodurch sterbenden Zellen zur Apoptose und möglicherweise anderen Todesmechanismen umzukehren. Daher erscheint anastasis physiologischen Heilungsprozesse, die auch beschädigte Zellen zu erhalten könnte unangemessen einzubeziehen. Die Funktionen und Mechanismen der Rekonvaleszenz sind noch unklar, zum Teil durch die begrenzte Tools zur Erkennung Ereignissen der Vergangenheit nach der Wiederherstellung der scheinbar gesunden Zellen behindert. Strategien zur Anasta erkennensis werden Studien über die physiologischen Mechanismen, die Gefahren von Untoten Zellen in Krankheitspathologie und potenziellen Therapeutika ermöglichen anastasis modulieren. Hier beschreiben wir effektive Strategien mit Lebendzellmikroskopie und eine Säugetier Caspase Biosensor zur Identifikation und Verfolgung anastasis in Säugerzellen.

Introduction

Apoptose (griechisch für "fallen in den Tod") wird im Allgemeinen angenommen, dass ein einseitiger Prozess endet in Zelle Selbstmord ^1-7 sein. Genetische Störung der pro-Tod Gene Ergebnisse in der Überlebensrate von zusätzlichen Zellen, die sonst in ganzen Tieren sterben würde, einschließlich Zellen, die bereits die Apoptoseweg ^8,9 eingeleitet haben. Auch genetische Manipulationen ermöglichen gesunden Säugetierzellen, die künstlich Anzeige "essen mich" Signale oder die Haftfähigkeit zu verlieren, ihre extrazellulären Matrix zum Tod durch Ganzzell-Phagozytose oder entosis bzw. ^10,11 entkommen. Jedoch haben wir und andere gezeigt, dass ohne genetische Manipulation normalen gesunden Säugetierzellen und Zelllinien, können auch aus den frühen Stadien der Apoptose ^12-15 erholen. Mit Werkzeugen, einzelne Zellen zu verfolgen, haben wir weiter gezeigt, sich nach späten Stadien der Apoptose ^12,13, nachdem Zellen wichtige Kontrollpunkte, dass typische gebenly markieren den "point of no return" ^2-6. Diese Checkpoints Stufe Apoptose spät schließen mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c, Aktivierung von Caspasen, eine Kernfragmentierung und Bildung von apoptotischen Körpern. Wir nahm eine griechische gesetztes Wort "Anastasis", das bedeutet "stieg auf Leben", um diese Umkehrung der Apoptose am Rande der Zelltod ^2-6 beschreiben.

Es sei denn, die gesamte Sterbe-Recovery-Prozess wird von lebenden Zellen beobachtet wird, wird es eine Herausforderung, Zellen, die anastasis aus Zellen, die nie apoptotischen Ereignisse erlebt unterzogen haben zu unterscheiden. Die jahrzehntelange Arbeit haben gezeigt, dass die morphologischen Merkmale der Zelltod durch Apoptose durch evolutionär konservierte biochemischen und molekularen Ereignisse ^16-19 angetrieben. Diese Veranstaltungen fördern die Selbstzerstörung der Zellen, Entwicklungs- und homöostatischen Prozesse in einzelligen und mehrzelligen Organismen durch die Beseitigung beschädigter oder d zu regelnangerous Zellen ^16-19. Während apoptotischen Zellen können leicht durch standardisierte morphologischen, biochemischen und molekularen Manifestationen Apoptose ^1,5,6,16,20 unterschieden werden, gibt es bisher keine bekannte Marker spezifisch anastasis ^12,13. Wichtig ist, dass Zellen, die anastasis laufen haben scheinen normale gesunde Zellen und Zellen, die gerade beginnen Umkehr Apoptose erscheinen als apoptotische sterbenden Zellen ^12,13 sein. Damit neue Werkzeuge erforderlich sind, um mit Gewissheit, dass ein bestimmter überlebenden Zellen zuvor erlebt aktiven apoptotischen Prozessen abzuschließen.

Apoptose ist im Allgemeinen als eine irreversible Kaskade angenommen, weil es eine schnelle und massive Zerstörungsprozess. Man könnte zwar Minuten bis Tage dauern für einige Zellen, die Apoptose auslösen, sobald Mitochondrien apoptogene Faktoren wie Cytochrom c in das Cytosol freigesetzt ^21,22 kann Caspasen innerhalb von 5 Minuten ^23,24 aktiviert werden, gefolgt von cytoplasmatischen undKernkondensation innerhalb von 10 Minuten ^{25 bis 27,} und Zelltod kurz danach ^25-27. Aktivierte Caspasen dirigieren Apoptose durch Spaltung und Inaktivierung wichtigsten strukturellen und funktionellen Komponenten für die Zwecke der zellulären Abbruch ^2,28, wie die Endonuklease-Inhibitor DFF45 / ICAD ^29,30. Caspasen aktiviert auch pro-apoptotischen Faktoren wie BCL-2-Familienmitglied BID, die Mitochondrien transloziert mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c ^31,32 fördern. Caspase-Aktivität führt auch zu Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin als "essen mich" Signal für die Förderung der Phagozytose von sterbenden Zellen durch Makrophagen oder Nachbarzellen durch Phagozytose ^33. Außerdem apoptotische Vorgänge machen Mitochondrien dysfunktional, Störung zellulärer Bioenergetik und Stoffwechsel ^34,35,36. So scheint Erholung von solchen Zerstörung intuitiv unwahrscheinlich.

Entgegen der ursprünglichen erwartentionen können Zellen die Apoptose Prozess noch in einem späten Stadium umzukehren. Durch die kontinuierliche Überwachung das Schicksal der sterbenden Zellen in Kultur, beobachteten wir die Reversibilität der Bühne Apoptose spät in einem Spektrum von primären Zellen und Zelllinien ^12,13. Die Entfernung der Tod Reizes Erholung von den offenkundigen Eigenschaften der Apoptose, wie mitochondriale Fragmentierung, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Plasmamembran Blasenbildung, Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom C, Caspase-Aktivierung, Kernfragmentierung, Zellschrumpfung, und Bildung von apoptotischen Körpern. Diese Beobachtungen werfen unbeantwortete Fragen zu den Funktionen, Folgen und Mechanismen der Rekonvaleszenz. Um diese Fragen anzugehen, ist eine Voraussetzung, um zuverlässig zu identifizieren Zellen, anastasis unterzogen wurden. Hier beschreiben wir Live-Mikroskopieverfahren und eine Caspase Biosensor zum Nachweis von Zellen, die zuvor rückgängig gemacht haben, spät Apoptose und then überlebt.

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen für das Live Cell Imaging Um den Nachweis von morphologischen Veränderungen zu erleichtern, wählen adhärenten Zellen wie HeLa (humane Zervixkarzinom-Zellen), die flach auf dem Substrat zur Änderung der Plasmamembran und intrazellulären Organellen besser zu visualisieren. Hinweis: Umkehr der Apoptose in verschiedenen Säugetierzellen 12,13, einschließlich primären Mausleberzellen, primären Maus-Makrophagen, primären Ratten-Kardiomyozyten beobachtet und auc…

Representative Results

Um die Auflösung der Apoptose zu untersuchen, werden Gewebekulturzellen zunächst auf einen Tod Reiz ausgesetzt, die Apoptose auslösen. Wenn die Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose wird frisches Kulturmedium dann angewendet, um abzuwaschen den Reiz und bebrüten die sterbenden Zellen der Besserung (1A) zu ermöglichen. Hier ist die entscheidende Frage angesprochen, wie weit einzelne sterben kultivierten Zellen gegenüber Apoptose Fortschritt und noch anastasis eingehen können. Diese Frage läs…

Discussion

Anastasis bezieht sich auf das Phänomen, bei dem Zellen, Zelltod aktiviert haben danach rückgängig den Sterbeprozess und zu überleben. Hier haben wir gezeigt, dass die Abbildung lebender Zellen verwendet werden, um zu bestätigen, dass die gleichen Einzelzellen in der Tat kann Apoptose-Prozess in einer späten Phase umkehren, und dann weiter überlebende und Wiedergabe werden. Unsere Protokolle beschreiben mehrere optimierte Zelltyp-spezifischen Behandlungsbedingungen, Apoptose zu induzieren und lassen einen großen…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LSM780 confocal microscopy	Carl Zeiss	/
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Transparent CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 independent medium	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
Fluorescently labeled annexin V	Biovision	K201