אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס
Summary
The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.
Abstract
Anastasis (יווני עבור "עולה לחיים") מתייחס להתאוששות של תאים מתים. לפני תאים אלה להתאושש, הם עברו דרך מחסומים חשובים של אפופטוזיס, כוללים פיצול של המיטוכונדריה, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום לcytosol, הפעלה של caspases, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ"א, פיצול גרעיני, blebbing קרום פלזמה, התכווצות תא, חשיפת תא שטח של phosphatidylserine, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. Anastasis יכול להתרחש כאשר גירויים אפופטוטיים יוסרו לפני המוות, ובכך מאפשרים לתאים למות כדי להפוך אפופטוזיס ומנגנוני מוות פוטנציאלי אחרים. לכן, Anastasis מופיע לערב תהליכי ריפוי פיסיולוגיים שיכול גם לקיים תאים פגומים בצורה בלתי הולמת. הפונקציות והמנגנונים של Anastasis עדיין אינן ברורות, הקשו בחלקו על ידי הכלים מוגבלים לאיתור אירועי עבר לאחר ההתאוששות של תאים בריאים לכאורה. אסטרטגיות כדי לזהות anastasis יאפשר מחקרים של המנגנונים הפיסיולוגיים, סכנות של תאים מתים בפתולוגיה מחלה, ורפויים פוטנציאליים לווסת Anastasis. כאן אנו מתארים אסטרטגיות יעילות באמצעות מיקרוסקופ תא חי וbiosensor caspase יונקים לזיהוי ומעקב Anastasis בתאי יונקים.
Introduction
אפופטוזיס (יווני "נופל למוות") הנחה הוא בדרך כלל להיות תהליך חד-כיווני המסתיים בתא התאבדות 1-7. הפרעה גנטית של תוצאות גני פרו-מוות בהישרדותם של תאים נוספים שאחרת היה מתים בכל בעלי חיים, כוללים תאים שכבר יזמו את 8,9 מסלול אפופטוזיס. באופן דומה, מניפולציות גנטיות מאפשרות לתאי יונקים בריאים באופן מלאכותי להציג "לאכול אותי" אותות או שיאבדו את הדביקות למטריצת החוץ תאית שלהם כדי להינצל ממוות על ידי phagocytosis כל תא או entosis, בהתאמה 10,11. עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי ללא תאי מניפולציה גנטית נורמלים בריאים יונקים ושורות תאים יכולים גם להתאושש מהמוקדמים של אפופטוזיס 12-15 שלבים. שימוש בכלים כדי לעקוב אחר תאים בודדים, יש לנו הפגנו נוסף התאוששות מהשלבים מאוחרים של אפופטוזיס 12,13, לאחר התאים עברו מחסומים חשובים שאופייניly לסמן את "נקודת אל-חזור" 2-6. מחסומים אלה של אפופטוזיס שלב מאוחר כוללים שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C, הפעלה של caspases, פיצול גרעיני, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. אנחנו אימצנו מילה יוונית מתחם "Anastasis", שפירושו "עולה לחיים", כדי לתאר את המהפך הזה של אפופטוזיס על סף מות תא 2-6.
אלא אם כן את תהליך גסיסה-ההתאוששות כולו נצפה על ידי הדמיה תא חי, הוא מאתגר להבחין בין תאים שעברו Anastasis מהתאים שמעולם לא חוו אירועים אפופטוטיים. עשרות שנים של עבודה חשפו כי תכונות מורפולוגיות של התאבדות תאים על ידי אפופטוזיס מונעות על ידי אירועים ביוכימיים ומולקולריים אבולוציונית שמורה 16-19. אירועים אלה לקדם הרס עצמי של תאים כדי לווסת תהליכים התפתחותיים וhomoeostatic באורגניזמים חד תאיים ורבים תאיים על ידי ביטול פגום או דתאי angerous 16-19. בעוד תאים אפופטוטיים ניתן להבחין בקלות על ידי גילויים מורפולוגיים, ביוכימי ומולקולריים אחידים של אפופטוזיס 1,5,6,16,20, כרגע אין סמן ידוע ספציפי לAnastasis 12,13. חשוב לציין, תאים שעברו Anastasis נראים תאים נורמלים בריאים, ותאים שפשוט להתחיל היפוך אפופטוזיס מופיע תאים מתים אפופטוטיים כ12,13. לפיכך, יש צורך בכלים חדשים לקבוע בודאות כי תא ששרד נתון חווה בעבר תהליכים אפופטוטיים פעילים.
אפופטוזיס מקובל להניח כמפל בלתי הפיך, כי זה הוא תהליך הרס מהיר ומסיבי. למרות שזה יכול לקחת דקות לימים לכמה תאים ליזום אפופטוזיס, פעם המיטוכונדריה שיחררה גורמי apoptogenic כגון ציטוכרום C לתוך cytosol 21,22, ניתן להפעיל caspases תוך 5 דקות 23,24, ואחריו cytoplasmic ועיבוי גרעיני בתוך 10 דקות 25-27, ותא מוות זמן קצר לאחר מכן 25-27. caspases הופעל לתזמר אפופטוזיס על ידי ביקוע וinactivating רכיבים מבניים ותפקודיים מפתח לצורך ההריסה הסלולרית 2,28, כגון מעכבי endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases גם להפעיל גורמים פרו-אפופטוטיים, כגון BID חבר BCL-2 משפחה, אשר translocates למיטוכונדריה כדי לקדם את שחרורו של המיטוכונדריה של ציטוכרום C 31,32. פעילות caspase גם תוצאות חשיפת תא שטח של phosphatidylserine כאות "לאכול אותי" לקידום בליעה למות תאים על ידי מקרופאגים או תאי שכנים דרך phagocytosis 33. יתר על כן, אירועים אפופטוטיים להבהיר המיטוכונדריה מתפקדת, שיבוש ביו-אנרגיה תאית ו34,35,36 חילוף חומרים. כך, התאוששות מהרס כזה נראה באופן אינטואיטיבי סבירה.
בניגוד למקורי מצפהations, תאים יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים אפילו בשלב מאוחר. על ידי ברציפות ניטור הגורל למות תאים בתרבית, צפינו הפיכות של אפופטוזיס בשלב מאוחר בטווח של תאים ראשוניים ושורות תאים 12,13. הסרת גירוי המוות אפשרה התאוששות מהתכונות הגלויות של אפופטוזיס, כגון פיצול המיטוכונדריה, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ"א, blebbing קרום פלזמה, חשיפה של phosphatidylserine פני תא, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום, הפעלת caspase, פיצול גרעיני, התכווצות תא, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. תצפיות אלה מעלות שאלות לא פתורות לגבי פונקציות, השלכות, והמנגנונים של Anastasis. כדי לענות על שאלות אלה, תנאי הוא לזהות באופן אמין תאים שעברו Anastasis. כאן אנו מתארים שיטות מיקרוסקופיה חיות וbiosensor caspase לגילוי תאים שהתהפכו אפופטוזיס שלב מאוחר וה בעברen שרד.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anastasis מתייחס לתופעה שבה תאים שהופעלו מסלול המוות של תאים לאחר מכן להפוך את תהליך הגסיסה ולשרוד. הנה, יש לנו הראינו שהדמית תא חי יכולה לשמש כדי לאשר שאותם תאים בודדים למעשה יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים בשלב מאוחר, ולאחר מכן להמשיך ולשרוד ולהתרבות. הפר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכומר ד"ר ראלף Bohlmann וכומר ד"ר ג'יימס Voelz למציעים את המילה "Anastasis" כדי לתאר את ההיפוך של אפופטוזיס; דאגלס ר 'ירוק לתאים הלה ביציבות להביע ציטוכרום C -GFP; Charles M. רודין ואריק א גרדנר לH446 תאים; הת'ר כבש לסיוע בציור קריקטורה בווידאו; איי הואי Yeo לדיון חשוב של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי אדוארד Youde זיכרון מלגת סר (HLT), מלגת ד"ר וולטר Szeto הזיכרון (HLT), מענק פולברייט 007-2,009 (HLT), מלגת מדעי חיים קרן המחקר (HLT), NIH מעניק NS037402 (JMH) וNS083373 (JMH), וועדת מענקי אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF). הו Lam טאנג הוא קרן עמית Shurl וקיי קורצ'י של מדעי החיים קרן המחקר.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | / | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
References
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
- Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
- Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
- Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
- Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
- Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
- Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
- Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
- Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
- Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
- Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
- Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
- Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
- Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
- Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
- Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
- Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
- Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
- Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
- Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
- Bertrand, R., Solary, E., O’Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).
